海洋假单胞菌将木质素转化为生物塑料的遗传解析

Lignin is the second most abundant biopolymer on the earth. However, due to the recalcitrant nature of the complex polyphenolic structure, the conversion of lignin to valuable products remains a major challenge for sustainable lignocellulosic biorefineries. In our previous study, we have screened a marine Pseudomonas putida strain A514 that can utilize lignin to produce polyhydroxyalkanoate (PHA). Preliminary genomic and proteomic analysis under different carbon sources revealed that A514 not only employs dye peroxidase-based and Fenton Reaction mechanisms for lignin depolymerization, but also has metabolically versatile pathways for aromatic compound catabolism. The proposed research will employ systems biology and genome engineering approaches to unravel the genetic foundations of A514. First, we will conduct transcriptomic studies under different nitrogen concentrations, which will be integrated to previous “-omics” analyses of A514, via the random matrix theory approach, to elucidate the molecular mechanisms of lignin-to-PHA conversion. Second, based on this systematic knowledge, we will design and implement corresponding functional modules in A514 to confer improved capacities for lignin depolymerization, efficient aromatic compound catabolism, and PHA production. Finally, we will integrate the three functional modules to optimize the metabolic network at the genome level to realize the direct production of PHA from lignin polymer. This scientific innovation will lay down the foundation of the lignin-to-PHA platform and provide novel solutions for more sustainable and cost-effective lignocellulosic biorefineries as well as the bioremediation of persistent organic pollutants in marine environment.

木质素是地球上第二大丰富生物质，由于结构复杂，难以被使用。因此，其高值化利用一直是制约木质纤维素生物炼制发展的关键瓶颈之一。申请人前期已从海洋中筛选到一株使用木质素产生物塑料的假单胞菌A514。基因组和蛋白质组研究表明A514使用染料过氧化物酶和芬顿反应协同解聚木质素，并具备多种芳香族化合物的代谢途径。以此为基础，本项目将使用系统生物学与基因组工程相结合的研究方法对A514产能机制进行遗传解析。首先通过在不同氮浓度下的转录组研究，结合前期组学结果，利用随机矩阵算法，阐明木质素到生物塑料的分子调控机制，以此指导主要代谢途径的（木质素解聚、芳香族化合物代谢、生物塑料合成）系统设计与改造，从基因组水平优化和重构A514代谢网络，构建高效的木质素制生物塑料工程菌株。该研究将为建立起高效木质素生物炼制平台奠定基础，为最大化持续发展木质纤维素生物炼制和降解海洋中与木质素结构类似的有机污染物提供新视角。

木质素是地球上第二大丰富生物质，由于结构复杂，难以被使用。因此，其高值化利用一直是制约木质纤维素生物炼制发展的关键瓶颈之一。申请人前期已从海洋中筛选到一株使用木质素合成生物塑料（PHA）的假单胞菌。但较低的转化率限制了其应用。目前细菌以木质素为底物,合成PHA的酶系，代谢途径以及遗传机理都不清楚，使得我们无法对其合理遗传改造以提高转化率。本项目围绕上述科学问题开展。首先，通过基因组和蛋白质组学数据分析，揭示假单胞菌以染料脱色过氧化物酶为主要木质素解聚酶系，并实验验证其独特的木质素解聚活性。其次，上述研究还指出了假单胞菌有限的胞外分泌能力是限制其木质素降解的主要屏障之一。故本研究通过不同的分泌策略，分泌表达了假单胞菌所缺乏的另一种木质素解聚酶漆酶，发现了不同形态的胞外酶对木质素解聚作用不同。第三，开发了适用于假单胞菌的高效的CRISPR-Cas9n基因编辑技术。第四，在上述工作基础上，发现阿魏酸是假单胞菌木质素解聚后主要芳香族物质之一。故通过基因编辑技术整合了含有九个基因的四个功能模块，提高了阿魏酸至PHA的转化。第五，系统考察了不同氮浓度下的PHA合成基因的转录水平，结合基因组和蛋白质组学数据，提出了一个经实验验证的同时提高细胞生长和PHA产量的策略。通过该策略，以木质素衍生体香草酸为底物，PHA产量可达到246 mg/L。最后，由于PHA合成与氮代谢密切相关，而目前缺乏氮代谢功能基因数据库，故本项目还构建了一个用于快速准确地进行氮循环基因分析的数据库NCycDB，解决搜索效率较低，基因家族同源性低，以及参与氮循环基因的测序序列覆盖率低等问题。目前已发表SCI论文3篇，还有2篇在同行评议中。培养2名博士生和1名硕士生。多次在国际学术会议上做口头报告。

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