新型高时空分辨NADH荧光蛋白探针的构建及成像技术

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31071260
项目类别：
面上项目
资助金额：
40.0万
负责人：
杨弋
依托单位：
华东理工大学
学科分类：
C0707.细胞变异与功能异常
结题年份：
2013
批准年份：
2010
项目状态：
已结题
起止时间：
2011-01-01 至2013-12-31

项目参与者：
尹琴；王雪；徐磊；赵玉政；陈显军；冯秀英；李松；
关键词：
NADH 代谢荧光蛋白分子探针分子成像

项目摘要

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）及其氧化型（NAD+）广泛参与了细胞内氧化还原反应、信号转导与基因调控，与人类重要疾病关系密切。由于NADH在代谢和信号转导中的中心作用及其在疾病诊疗中的重要性，对组织、细胞内NADH的分布进行生物成像将为相关研究提供重要的信息。但长期以来应用的NADH自发荧光成像的方法存在重大缺陷，目前国际上对于NADH尚无有效的高时空分辨的在体检测方法，严重制约了相关研究的发展。本研究试图基于分子结构理性设计与蛋白质工程方法，从头构建灵敏、特异检测NADH的基因编码荧光蛋白探针，并利用这一新探针建立监测NADH在活体、组织、细胞甚至亚细胞结构中分布的高时空分辨成像技术。本研究不仅将可为对生命科学基础研究提供有力工具，还可以用于构建病理、药理模型，为人类疾病的诊疗研究提供新的手段，并可推动生物工程、代谢工程等应用基础领域的研究，具有很好的理论意义及社会经济意义。

结项摘要

我们发展了一系列可以特异性检测NADH的遗传编码荧光蛋白探针，可以用于检测细胞代谢及氧化还原状态。这些探针是将将感受NADH的Rex蛋白与环化的黄色荧光蛋白组合，它们可以特异性地识别NADH分子，同时展现大范围的荧光光谱变化。我们命名这些探针为Frex及FrexH，它们完全由基因编码，很容易导入细胞并定位于不同的亚细胞结构，因而可以可以被定位到。精确测定人体细胞不同亚细胞结构内自由NADH分布水平，实时动态看到人类等哺乳动物细胞内葡萄糖代谢、线粒体呼吸链功能、氧化还原调控条件下NADH代谢情况。我们还发现NADH可以自由跨膜进入细胞内调控多种生命活动，以及线粒体与细胞浆NADH响应在时间上的分离。基于大量的实验数据，我们提出了胞浆中的NADH是对人体生理条件改变非常敏感的，而线粒体有很强的维持生理NADH 稳态的观点。此外，我们还制备了稳定表达探针的癌细胞柱，将其在裸鼠上制备移植瘤后，可以利用活体动物荧光成像手段观察到尾静脉注射丙酮酸后肿瘤代谢的变化。由于NADH在代谢和信号转导中的中心作用及其在疾病诊疗中的重要性，对组织与细胞内NADH的分布进行生物成像将为人们更好地了解物质与能量代谢的调节机制提供重要的创新工具与手段。