基于酪氨酸激酶和Wnt信号通路的多靶点抗癌药物发现

Tyrosine kinase and Wnt signaling pathway play an important role in development and tumorigenesis, and the deregulation of tyrosine kinase and Wnt signaling results in the formation of tumors. The project focuses on the discovery of new antitumor compounds with quinazolin moiety on the basis of tyrosine kinase and Wnt signaling pathway. The research includes mainly as follows: .1.The design and virtual screen of new compounds will be performed by using the computer assisted drug design. Several virtual compound databases will be established by introducing stilbene unit possessing the inhibition of Wnt signaling pathway to quinazolin scaffold with tyrosine kinase inhibited effect. New compounds will be screened through the docking the compound in virtual database to the active site of some important target proteins such as EGFR, VEGFR and the proteins expressed in Wnt signaling pathway..2.Selected new compounds will be synthesized. Firstly, stilbene unit is constructed using a new method developed by our laboratory. Then, the formation of quinazolin scaffold and the introducing of stilbene unit will be done at the same time via Dimroth rearrangement reaction. .3.Synthesized compounds will be submitted to the determination of antitumor activities in vitro and vivo to find new antitumor agents..4.Antitumor mechanism will be studied through the determination of the expression of EGFR, VEGFR, Axin2, β-catenin in cancer cells treated with high active compounds and the determination of the inhibition effect of the compounds on EGFR, VEGFR.

以与癌密切关联的酪氨酸激酶和Wnt信号通路为靶点，发现具有喹唑啉母核的抗癌新化合物。包括①设计：用药物设计软件以喹唑啉母核为药效基团，在其上接入对Wnt信号通路有抑制作用的二苯乙烯结构单元和其它增效基团，建立虚拟化合物库。以酪氨酸激酶受体EGFR、VEGFR等及Wnt信号通路中的关键蛋白为靶点，将库中每个化合物与靶蛋白进行对接打分，对综合得分较高的新化合物进行化学合成。②合成：采用本实验室建立的新方法进行二苯乙烯类化合物的合成；通过Dimroth重排反应进行喹唑啉母核的形成及与二苯乙烯结构单元的连接，以合成得分较高的新化合物。③活性筛选：对合成的化合物通过体内外抗癌活性实验进行筛选，以获得低毒、高效的多靶点抗癌临床候选药物。④抗癌机理：以受试药物对EGFR、VEGFR、Axin2、β-catenin等在癌细胞中的表达和对EGFR、VEGFR活性的影响进行机理研究，以揭示其抗癌的作用规律。

该课题以喹唑啉母核为药效团，利用计算机辅助药物设计软件给其4-位氨基及6,7-位导入多种不同的结构单元生成了含有4122个化合物的虚拟化合物库；以EGFR蛋白为受体对库中化合物通过分子对接进行虚拟筛选，结合归类分析选定了虚拟的目标化合物；对这些目标化合物进行化学合成得到了44个新的喹唑啉衍生物，对这些化合物通过多种波谱手段进行了结构鉴定。在这些化合物的合成过程中，对一些重要中间体的合成方法进行了优化。以DMF、硫酸二甲酯和芳胺直接为原料，得到了一种制备芳基甲脒中间体的便捷方法，该方法省去了DMF-FMA的制备步骤。对于中间体对硝基苯丙烯的合成则直接选用对硝基溴苯和丙烯为原料，直接通过Heck反应获得了该中间体，避免了以前该化合物合成的繁琐方法。对合成得到的所有最终目标化合物利用MTT法，在A431、A549、NCI-H1975和SW480 四种人肿瘤细胞上进行了活性评价，筛选出了2个活性较高的化合物iii-A和iii-B。iii-A在4种肿瘤细胞上的IC50分别为1.35±0.32、8.83±3.80、5.53±0.30和6.08±0.32；iii-B在4种肿瘤细胞上的IC50分别为1.31±0.55、1.65±0.29、4.87±0.68和3.27±1.25，它们所表现出的活性明显高于阳性对照gefitinib和lapatinib。为揭示这些化合物对肿瘤细胞的作用机理，化合物iii-A和iii-B对EGFR的活性抑制作用通过ELISA方法进行了测试，结果表明二者对EGFR活性抑制的作用强于lapatinib，但略低于gefitinib。通过对A549细胞的Western bloting分析表明2个化合物均具有明显抑制EGFR磷酸化的作用，并且对EGFR的下游信号蛋白Akt和Erk1/2的磷酸化水平有明显下调作用。对NCI-H1975细胞的Western bloting分析结果依然表明2个化合物对其EGFR的磷酸化有抑制作用，但对下游信号蛋白Akt和Erk1/2的磷酸化水平没有明显的改变。这些结果整体说明所得到的两个活性较高的化合物是具有潜力的EGFR抑制剂，有必要对其进行更为深入的研究。

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