心肌素介导长链非编码RNA对平滑肌前体细胞的功能调控及其在血管组织工程中的应用

Smooth muscle cell (SMC) loss or dysfunction affects multiple tissues and organs in the body. Thus, cells and technologies capable of generating scalable and autologous sources of SMC are of great interest. In this study, we will continue our effort to investigate the molecular basis of myocardin (MYOCD), the master smooth muscle regulator, in modulating its downstream signalling which may regulate the function of smooth muscle progenitor cells (SMPC). Long non-coding RNAs (lncRNA) have been recently recognised by their diverse functional characteristics in several disorders including cardiovascular diseases. Based on our preliminary results we propose the hypothesis that there exists a potential regulatory loop between MYOCD-mediated lncRNA and the upstream KLF4 which is the key transcriptional inhibitor of the MYOCD gene. We will identify new KLF4-binding lncRNAs via RNA-binding protein immunoprecipitation, and confirm their antagonistic effect on the MYOCD-promoter region. The competition from MYOCD-mediated-lncRNA binding to KLF4 may induce smooth muscle differentiation. Next, we will further explore the functional role of MYOCD-mediated lncRNA in modulating SMPC-derived SMC differentiation and the phenotypic switch. Inhibition of toll-like receptor 4 (TLR4) signalling which has been shown to effectively attenuate the pathogenesis of atherosclerosis will be our ultimate goal to elucidate the ideal molecular cues for vascular homeostasis. Finally, these studies will contribute to the development of new molecular targets by manipulating the KLF4-MYOCD-lncRNA pathway as well as TLR4 signalling for SMC phenotypic modulation. We anticipate that the innovative outputs from this project will be essential for improving stem cell-derived vascular tissue bio-engineering.

平滑肌损伤或功能障碍影响多种组织的功能，因此发展可再生的平滑肌细胞技术有重要的临床实用价值。本研究旨在进一步明确心肌素（MYOCD）对平滑肌前体细胞基因调节的分子机制和交互作用，重点研究其如何调控细胞分化和表型。长链非编码RNA（lncRNA）在血管病理发展中的作用是目前的研究热点。基于前期研究基础，我们将进一步证实MYOCD介导的lncRNA能够拮抗上游转录阻遏物KLF4对MYOCD基因的靶向作用，从而设计更好的诱导平滑肌细胞分化的技术。我们将选取能与KLF4结合的lncRNA，确认其表达是否会拮抗KLF4与MYOCD启动子的交互作用。然后利用我们所建立的平滑肌前体细胞立体培养模式，深入研究MYOCD所调节的lncRNA对血管平滑肌细胞的分化和表型调制的影响。最后，通过操纵KLF4-MYOCD调节的lncRNA和抑制TLR4，来实现平滑肌细胞表型的定向转换，以利于将其应用于血管组织工程。

本课题致力于探讨长链非编码RNA（lncRNA）在平滑肌细胞分化中所扮演的角色, 在平滑肌细胞分化期间，我们已完成心肌素(MYOCD)基因对表达Islet-1的平滑肌前体细胞族群的调节机制，确定新的KLF4结合的位点，在可控条件下进一步研发使用非病毒转染的系统以特异性地抑制其结合位点。我们鉴定了几个涉及H19介导的下游信号传导的新颖的lncRNAs。这些数据表明H19在心肌素转录调节，和lncRNA-mRNA相互作用组中作为负调节因子的新作用。其中LNC000093在H19-siRNA处理后表达上调，并发现了其具有与H19所产生的miRNA-675-5p结合序列 - 具有完整的种子序列（GGUGCG），它们接近LNC000093转录本的3'末端，即BR1 [971-1,008] ，BR2 [1,237-1,268]和BR3 [1,302-1,322]。当我们在人类骨髓间质干细胞中大量表达LNC000093, 显着上调MYOCD的表达, 并进一步下调抑制因子KLF4 mRNA表达（p < 0.01）。在lncRNA H19抑制的细胞群，我们测定成熟平滑肌细胞表型标记的表现，加上免疫萤光染色确认特有标记所占有的细胞比率。另外, 最新发现LNC000093参与MYOCD所调控的炎症小体(inflammasome)活化路径, 其中NLRP3标志在大量表达LNC000093将更为上调, 其余相关路径例如NLRP1, TLR-4, AIM2正在进一步分析。为了产生微流体环境以建立微流体为基础的血管组织工程，我们已经采用了具有灌注流动系统（BioFlux on Biosciences）的两个独立环形通道的孔板，并与两个培养隔室相互连接以供本研究中使用。再者, 我们的研究组除了人类骨髓间质干细胞分化之外,并已建立人类诱导干细胞(iPSC)的分化模式,并经过CRISPR-Cas9剃除LNC000093,确认了其在初期分化显着调控标志基因的表达。我们课题研究组并已完成单细胞测序(scATAC-seq), 以深入了解LNC000093新颖lncRNA在血管细胞分化中, 在特异细胞族群中的全基因组调控。

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