新的突变型RHCE*ce(Pro103Leu)等位基因与RhCE抗原异常表达的分子遗传学研究

The little c antigen in Rh blood group is encoded by RHCE*ce and cE alleles and the amino acid (103pro) encoded by the polymorphism (307C) is the most critical residue for its normal expression. In recent study, some mutant RHCE*ce alleles were indentified which encoded the variant antigens lacking of several epitopes. The mutant carriers could produce alloantibodies against the miss epitopes of antigen resulting in severe transfusion reaction and hemolytic disease of the newborn (HDN). One novel mutant RHCE*ce(Pro103Leu) allele was identified by us previously, which resulting in Pro103Leu. Ten kinds of monoclonal anti-c were used to detect the expression of c antigen in one proband by FACS analysis. The results showed the absence of epitope 2, 4, and 5 of c antigen and the weak expression of epitope 1 and 3. In this study, we plan to collect more probands’ samples to analyze the expression of the related RhCE (c, e, and C) antigens systematically. Besides, the expression of RHCE*ce(Pro103Leu) allele in vitro will be conducted to confirm the molecular basis for the aberrant expression of c, e, and C antigens in mutation carrier and clarify the mechanism of the variant expression of RhCE antigens. It will ensure the accurate typing of RhCE antigens and the safety of transfusion in patients with the mutant RHCE allele.

Rh血型系统常见的c抗原由RHCE*ce和cE等位基因编码，其307C核苷酸位点编码的103位脯氨酸（Pro）是该抗原正常表达最关键的氨基酸。近期研究发现，一些RHCE变异型等位基因可编码某些表位缺失的RhCE抗原，在免疫暴露时产生相应抗体，导致严重输血反应及新生儿溶血病。我们前期报道了一条突变型RHCE*ce(Pro103Leu)等位基因，新的308C>T突变导致103位脯氨酸突变为亮氨酸（Leu），采用10种单克隆抗c对1例先证者红细胞检测，发现其c抗原表位2、4和5缺失，表位1和3弱表达。本项目拟在此基础上，收集更多突变样本，对相关c、e和C抗原表位进行流式细胞鉴定，并进行体外表达研究，验证RHCE*ce(Pro103Leu)等位基因是否为突变携带者RhCE抗原异常表达的遗传基础，以阐明RhCE变异型形成的分子机制。为保障RhCE变异型患者正确血型鉴定和提高输血安全奠定基础。

红细胞血型的准确鉴定是避免同种免疫所致输血反应的基础。Rh系统是ABO以外最重要的血型系统之一，相关抗体可导致致死性输血反应及严重胎儿新生儿溶血病。近年来，随着RhD变异型研究的深入，一些国家已经针对常见RhD变异型患者制定了输血指导策略。相比而言，RhCE变异型相关研究仍很缺乏。RhCE包括C、c、E和e抗原，由RHCE*ce、Ce、cE和CE等位基因编码。我们前期在200例RhD阴性献血者中发现了4例携带有新突变型RHCE*ce(Pro103Leu)等位基因个体，其308C>T突变导致编码c抗原的第103位关键氨基酸由脯氨酸（Pro）突变为亮氨酸（Leu），亦不同于C抗原对应位点的丝氨酸（Ser）。本研究在此基础上，首先建立了针对RHCE*ce308T突变位点的Real-time PCR方法，对新收集的800例RhD阴性、1000例RhD阳性标本和400例RhD放散型样本进行了筛查，在RhD阴性献血者中新发现了2例携带有该突变的献血者，从而推测该等位基因在RhD阴性人群中的频率约为0.3%（6/2000）。随后对新获得红细胞样本血型血清学方法和流式分析，发现其c抗原不表达，而表达弱的C抗原反应活性。通过构建RHCE*ce308T突变表达载体，体外慢病毒感染cDe/ce和CDe/CDe基因型个体外周血培养的有核红细胞，显示其不表达c抗原，而表达C抗原活性，结果与红细胞表型一致，从而证实了RHCE*ce308T是该基因型个体C抗原弱表达及c抗原不表达的分子基础。在完成项目计划基础上，本项目还对中国人群中其他常见RhCE变异型血型相关分子遗传背景进行了研究。即采用两种不同的RhCE抗原单克隆抗体，在4514例献血者样本中，发现了2例e抗原弱表达样本。随后在这两例样本中，首次发现了中国人群的RHCE*Ce667T和RHCE*Ce375G突变型等位基因，流式结果显示其C、c和E抗原也有一定程度表达减弱。通过体外培养RHCE*Ce375G先证者有核红细胞，提取mRNA，获得了突变等位基因mRNA全长序列。最后，建立了针对RHCE*Ce667T等位基因突变位点的特异性熔解曲线分析方法，可用于人群基因频率检测。本研究将为中国人群中携带RHCE*ce308T以及RHCE*Ce667T和RHCE*Ce375G等位基因的RhCE变异型患者血型正确鉴定及输血原则制定奠定基础。

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