利用iPS技术修复X染色单体缺陷及其机制的研究

Turner's syndrome (TS) 45,X takes up 19.22% of all aneuploids during embryo development, which is one of the most common chromosome disorders and the only monosomic syndrome that the affected fetuses may survive to term; however, there is no cure for this disease. This year, Shiya Yamanaka reported cell-autonomous correction of ring chromosomes using induced pluripotent stem cell (iPS) technique, which successfully repaired large-scale chromosome abnormalities and provided new methods for treatment of chromosome disorders. In a preliminary study, the applicant had attempted to repair 2 (45,X) TS somatic cells using the iPS technique, one of which was successfully corrected to be 46,XX and could be passaged stably. Further STR analysis showed that its X chromosomes before and after cell reprogramming are homozygous. Thus, we postulate that iPS technique can repair X monosomy. This project plans to pick 10 TS somatic cell lines for cell reprogramming, and use FISH and SNP chip to verify autonomous correction of X monosomy by iPS technique. The generated iPS cell lines will then be classified according to their changes in karyotypes after cell reprogramming. Via investigating the aCGH and trascriptomic alternations between different groups of iPS cells, we will identify the key regulators for autonomous correction of X monosomy, reveal the molecular mechanism of cell reprogramming-mediated X chormosome repair, discover new therapy target for monosomy and provide new methods for treatment of chromosome disorders.

特纳综合征TS(45,X)在胚胎染色体发育异常中占19.22%，是最常见的染色体缺陷类疾病之一，人类唯一能生存的单体综合征，但目前无特异性治疗方法。今年山中伸弥利用诱导多能干细胞（iPS)技术使正常染色体成功替代环状染色体，修复了大规模的染色体缺陷，为染色体缺陷疾病的治疗带来了重要启发。申请者前期尝试利用iPS技术修复2例(45,X)TS细胞，1例成功修复为46,XX并能稳定传代，经STR验证重编程前后X染色体均为纯合子。因此我们推断iPS技术能修复X染色单体缺陷。本课题拟选取10例TS细胞进行重编程，采用FISH、SNP芯片等技术进一步验证iPS技术能否修复X染色单体缺陷。根据重编程前后核型的变化对iPS细胞系进行分类，结合aCGH技术和表达谱芯片等方法，比较筛选出X染色体自动修复的关键基因，揭示重编程介导X染色体修复的分子机制，发现单体综合征新的治疗靶点，为其治疗提供新的方法与思路。

特纳综合征TS（45,X）在胚胎染色体发育异常中占19.22%，是最常见的染色体缺陷类疾病之一，人类唯一能生存的单体综合征，患者会出现不孕不育、心血管畸形等多种症状，但目前尚无特异性治疗方法。2013年，诺贝尔奖得主山中伸弥教授开创性地利用诱导多能干细胞（iPS）技术修复了两种环状染色体缺陷，为修复大规模的染色体缺陷类疾病带来了重要启发。在本项目中，我们证实了iPS重编程技术也可以修复TS（45,X）染色体缺陷，核型成功修复为46,XX，并利用高密度SNP芯片和转录组芯片技术研究其分子机制。我们发现：1）25%的TS（45,X）体细胞可以通过iPS重编程修复为正常核型（46,XX）的iPS细胞；2）在成功修复的体细胞重编程过程中，发生了X染色体单体的补偿性单亲双倍体（UPD），这是细胞核型从45,X变为46,XX的分子机制；3）X染色体在补偿性UPD修复后发生正常的X染色体失活（XCI），使得X染色体的基因表达剂量恢复正常，这是细胞表型恢复正常的分子基础；4）X染色体上的长非编码RNA（lncRNA）基因XIST、XACT的杂合性缺失与倾斜性XCI相关；5）可以成功修复的体细胞中，表达较低的细胞周期调控基因，包括纺锤体组装检查点调控基因BUB1、BIRC5、CDC20等，以及分离检查点调控基因BRCA1、CDK1、TOP2A等，这些基因有可能开发为新的生物标志物，判断细胞是否适合iPS重编程技术介导的染色体修复；6）建立了高特异性的CRISPR系统设计方法和调控内源性基因表达的CRISPR工具，为进一步的分子机制研究奠定基础；7）建立了高效的iPS心肌分化方法，为进一步的分化功能研究奠定基础。本项目成功揭示了iPS重编程技术介导X染色体缺陷修复的分子机制，发现染色体缺陷类疾病新的生物标志物，为其治疗提供新的方法与思路。

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