基于识别Fn14受体的生物稳定型胰腺癌靶向多肽筛选及相关研究

One major challenge in tumor therapy is how to selectively deliver anticancer agent to tumor cells.Targeting ligands that confer 'smartness' (biological recognition) to drug-loaded particles play a vital role in the targeted tumor therapy. Recently, the transmembrane receptor Fn14 was found to be overexpressed in pancreatic cancer and other solid tumor cell lines and thus may provide a potential biomarker for diagnosis and treatment. .The proposal aims to obtain biostable, high-affinity peptide ligands of Fn14 that are capable of differentiating the pancreatic cancer cells from normal tissues to achieve specific targeting and enhanced antitumor effect in vitro and in vivo. The first step is preparation of the extracellular cysteine-rich domain of Fn14 as the target protein via solid-phase synthesis and orthogonal folding. The following is to screen and optimize the D-peptide ligands by a novel mirror-image mRNA display technique derived from the combination of mRNA display and 'enantiomer inversion' strategy. And then is the construction of D-peptide modified drug-loaded micelles and therapeutic efficacy evaluation in vitro and in vivo. .Peptides, because of their large interacting surfaces, offer the prospect of enhanced potency, high specificity and low toxicity. However, most bioactive peptides suffer the limitation: poor stability in physiological environments. The biostable functional peptide screening from the synthesized extracellular self-stablized domain of Fn14 protein presented here will provide new ideas for transmembrane receptors recognition and related diseases diagnosis and treatment.

针对目标细胞表面特异受体筛选相应配体，以介导载药系统主动寻靶是实现肿瘤靶向治疗的重要策略之一。近期研究发现，跨膜受体Fn14过度表达于胰腺癌等实体瘤，有望成为疾病治疗的潜在靶标。基于此，本项目拟以Fn14胞外半胱氨酸富含区为靶蛋白，经固相合成与"定位折叠"法制备并表征；在此基础上利用"镜像mRNA展示技术"筛选其D型多肽配体并优化；进一步开展D型多肽修饰的载药纳米胶束构建与评价，以期达到：获得具有胰腺癌靶向功能的D型多肽，该多肽高效介导药物定位攻击病灶，有效抑制癌瘤。多肽对蛋白质具有天然的高亲和力和专一性，因此多肽类分子在重大疾病相关蛋白的识别、调控等研究中扮演了重要角色，但天然L型多肽大多易被体内酶降解，生物半衰期短，应用受到限制。本项目基于合成Fn14胞外自稳定的结构域而开展生物稳定型（D型）功能多肽筛选的探索研究，将为跨膜受体识别及其相关疾病诊断与治疗研究提供有益的思路。

针对目标细胞表面特异受体（蛋白）筛选相应配体（导向分子），以介导载药系统主动寻靶是实现许多疾病靶向治疗的重要策略之一。与小分子或生物大分子相比，多肽作为导向分子介导靶向递药具有易于制备、易于定位修饰、渗透性相对较强和潜在免疫原性低等优点。然而，如何获得适宜的多肽导向分子仍面临重要挑战：现有主要筛选/设计技术获得的是天然L型多肽，往往易被体内酶降解，生物半衰期短，其介导靶向递药的效率受到显著影响；基于“构型转换策略”的镜像配体筛选技术（以镜像噬菌体展示技术为代表）理论上能够针对特定靶蛋白筛选得到全D型、具有高度生物稳定性的多肽配体，该类技术依托于对靶蛋白的化学全合成，在面对分子量较大、结构复杂的蛋白质时存在困难，以至于筛选细胞表面蛋白（受体）的D型多肽配体尚未见报道。本项目为此进行了积极探索，提出了针对经多对二硫键固定、具有特定结构的胞外半胱氨酸富集区（CRD）开展全D型多肽配体筛选的策略。这类CRD通常约40-80个氨基酸长度，化学全合成和折叠相对容易，其结构相对独立、稳定并不易失活，具有能有效替代整体受体蛋白用于配体筛选及识别的潜力。项目以具有胞外CRD的跨膜受体Fn14为靶点，该受体过度表达于胰腺癌、三阴性乳腺癌等，同时也在肿瘤相关成纤维细胞上大量表达。通过优化制备方法，能得到直接线性连接（无需片段拼接）、一步折叠（同时形成正确配对的三对二硫键，无需分步折叠）、高纯度的Fn14胞外 CRD蛋白。进一步分别采用镜像mRNA展示和镜像噬菌体展示技术，均筛选得到亲合力强、特异性识别Fn14的全D型多肽配体。以上述全D型多肽为导向分子构建的递药系统通过先后靶向肿瘤相关成纤维细胞和胰腺癌细胞上Fn14受体，能有效突破胰腺癌肿瘤外周基质屏障，在难渗透性胰腺癌的靶向递药及治疗方面表现出明显优势。类似效果也在其他多种Fn14上调相关疾病的靶向治疗研究中得到验证。我们还尝试进一步丰富和提升本项目的研究内涵：对于胞外不含有CRD的受体蛋白，可将其关键序列“嫁接”到结构类似、经多对二硫键固定的蛋白模板后生成“人造CRD”，以该人造蛋白替代原受体蛋白进行靶向识别与递药相关研究。总之，本项目基于合成富含二硫键的自稳定结构域开展生物稳定型多肽配体筛选、靶蛋白识别及靶向递药的探索研究，取得明显成效并将继续深入开展相关研究，将为跨膜受体识别及相关疾病诊断与治疗研究提供有益思路。

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