新型可基因编码的长寿因子活性检测探针的研究

Sirtuins are NAD-dependant deacylases thar are found in all organisms. In mammalian cells, there are seven subtypes of sirtuin that participate in a number of biological processes, ranging gene expression, metabolism to cellular stress response. Sirtuin function is related to aging and aging-related diseases, and therefore sirtuin is an important drug target. Unfortunately, the study of sirtuin is suffering from the lack of detection tools with high reliability, high selectivity, fast response and easy operation. Herein, the applicant proposes the use of genetically encoded sirtuin probe based on genetic code expansion to overcome the drawbacks of exsiting probes, including molecular instability, tendency of false positive result et al., while summarizes the weakness and challenges of this approach. A series of solutions combining synthetic chemistry, protein engineering, directed evolution et al., have been proposed, in order to estabilish a highly reliable and fast-response method for sirtuin detection and realize the selective monitoring of sirtuin subtype activity in living cells.

Sirtuin是细胞中普遍存在的一类依赖NAD的蛋白质去酰基化酶，在哺乳细胞中有七种亚型，调控着从基因表达、新陈代新到细胞应激反应等许多生理过程，与生命衰老及衰老有关的疾病密切相关，是重要的药物作用靶点。因缺少可靠性高、选择性好、检测快速且简便易操作的活性检测手段，sirtuin的相关研究受到了极大的制约。申请人提出了使用基因密码子扩展技术开发基因编码型sirtuin检测探针的方法，可克服现有检测探针诸如分子稳定低、易造成假阳性结果等弊端，同时凝炼了目前工作中的不足和挑战，提出了基于合成化学、蛋白质工程、直接进化等手段的一系列解决方案，目标在于建立快速可靠的sirtuin检测方法以及实现sirtuin在细胞内的亚型选择性检测。

Sirtuin是一种依赖NAD的蛋白质去酰基化酶，在基础生物学研究和药物研发中发挥着重要作用。本项目针对了sirtuin活性的准确检测这一科学问题，希望通过基因密码子扩展技术来构建基于蛋白质（特别是荧光蛋白）的sirtuin活性检测探针，实现sirtuin活性的快速检测和在细胞内的亚型选择性检测。在项目的执行过程中，我们优化了sirtuin在大肠杆菌内的荧光活性检测体系，提高了检测灵敏度和sirtuin亚型覆盖度。对于亚型选择性检测，我们编码不同的酰基化赖氨酸来开展研究，然而实验结果表明sirtuin亚型对不同酰基化赖氨酸的选择性很低，提示文献研究中可能的偏差。利用编码的非天然氨基酸，我们开展了广泛的sirtuin去酰基化活性研究，揭示了一些过去未知的活性，如SIRT6的去硫辛酰化活性。另一方面，我们还初步探索了一种生物正交的蛋白质赖氨酸酰基化和去酰基化体系，代表了一种新型的蛋白质翻译后修饰研究工具。此外，我们还首次实现了谷氨酸衍生物的基因编码，可用于多种蛋白质修饰类型的构建。

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