靶向筛选高保真的FnCpf1用于哺乳动物基因组编辑

The most exciting applications of the CRISPR/Cas9(Cpf1)-mediated targeted gene editing technologies are the results of curing genetic diseases with animal disease models as the next generation biotech drug. Off-target effects are still the key issue for the application for the FnCpf1-mediated genome engineering for patients and dissection of mammalian gene function. To address it, different strategies have been adopted, while, so far, it has not been satisfactorily solved. To identify high fidelity FnCpf1, a member of Cpf1 family, which has genome editing activity from our previous study, here we will generate a large library of FnCpf1 variants and screen with the reporter platform/E.coli based selection. Also, direct repeat sequence is one of key components for FnCpf1’s function; in principle, its engineering should be linked with the alteration of the corresponding activity and fidelity. Then we will take advantage of this specific high fidelity FnCpf1 system with another gene editing tool, AAV, to perform in situ genetic correction of X-linked juvenile retinoschisis patient-specific RS1 mutation. The development of the new high fidelity FnCpf1 system will pave a way for the clinical in situ gene therapy and dissection of mammalian novel gene function.

FnCpf1作为新一代的基因治疗药物在疾病的治疗上和哺乳动物基因功能解析上具有广阔的应用前景，但最重要的缺点在于DNA识别与切割过程中出现的脱靶问题。目前该重要科学问题仍然没有得到很好解决。鉴于此，本研究拟以获得新型高保真FnCpf1系统为研究导向，通过多种方法对FnCpf1蛋白编码基因进行定向改造并获得大规模携带有突变FnCpf1的突变库，突变相关的DR序列，以带有报告基因的HEK-293细胞等为靶细胞，结合细菌筛选体系，筛选出新型高保真FnCpf1系统。在此基础上，利用此新型高保真FnCpf1系统对性连锁少年性视网膜劈裂致病基因RS1进行修复。本项目的开展对探索基于FnCpf1的新型生物技术药物来治疗疾病和哺乳动物基因功能的解析具有重要意义。

FnCpf1(FnCas12a)作为新一代的基因组编辑工具在疾病的治疗上和基因功能解析上具有广阔的应用前景，但该工具仍然有一些缺点。鉴于此，本研究拟以获得新型FnCpf1系统为研究导向，通过多种方法对FnCpf1蛋白编码基因进行定向改造并获得大规模携带有突变FnCpf1的突变库，突变相关的DR序列，利用特定的筛选系统，筛选出新型FnCpf1系统。经过项目的执行，完成了FnCpf1突变库的构建，利用前期建立的方法对突变体进行了筛选，并获得了高活性和有保真性的FnCpf1。该工作对于基因编辑的应用奠定了较好的基础。同时，考虑学科的发展，项目研发了高保真的SauriCas9。因为SauriCas9具有分子量小等优点，另外对PAM识别具有一定的灵活性，所以，SauriCas9在基因治疗方面具有一定的优势。高保真的SauriCas9对于FnCpf1具有一定的互补性。另外，构建了基于GFP-TK-NEO的基因编辑效率评估系统。评估系统对于研发新型基因编辑工具具有重要意义。该系统可以实现多种不同酶的识别，对研究和优化基因编辑酶奠定了基础。考虑到基因编辑作为新型技术，将其应用于生物医学将可以更好的实现其价值。利用FnCpf1的旁切活性，研发了针对流感耐药基因和球虫的分子检测。这些应用研究为FnCpf1用于病原体检测提供了技术支撑。建立了RNP为基础的球虫基因编辑方法。这些为球虫新一代疫苗研发奠定了坚实的基础。本项目的完成对探索基于新型生物技术药物来治疗临床疾病、分子育种，疫苗研发和基因功能解析具有重要意义。

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