Kisspeptin在调控金鱼垂体生长催乳素(SL)表达中的作用机制研究

Somatolactin (SL), a member of the growth hormone family, plays an important role in fish growth and reproduction. Our pilot studies demonstrated that kisspeptin could induce goldfish SL expression in a time-dependent manner and activate intracellular cAMP/PKA, PKC, MAPKs and calcium signaling pathways in primary cultured goldfish pituitary cells. These findings promote us to hypothesize that kisspeptin may directly induce SL expression at the goldfish pituitary level through activating multiple intracellular signaling pathways. To substantiate this hypothesis, using goldfish as an animal model, our study aims to: 1) examine the co-expression profiles of kisspeptin/GPR54 and SL in goldfish pituitary cells; 2) verify whether kisspeptin can regulate SL gene transcription, mRNA stability, protein synthesis and release in primary cultured goldfish pituitary cells; 3) test whether the cAMP/PKA, PLC/PKC, MAPKs and calcium signaling pathways are directly involved in kisspeptin-induced SL mRNA expression, protein synthesis and release in primary cultured goldfish pituitary cells.The proposed study will provide novel insights into the regulatory mechanism of SL expression in the fish pituitary cells and its potential applications in aquaculture.

生长催乳素(SL)属于生长激素家族成员，在鱼类生长、繁殖过程中起重要作用。我们的初步研究结果表明：kisspeptin（kp）可时间依赖性诱导金鱼垂体SL表达，并且kp处理可激活垂体细胞cAMP/PKA、PKC、MAPKs和钙离子等信号传导通路。据此，我们首次提出："kp或可通过激活多个胞内信号传导通路，参与调控金鱼垂体SL的表达"。为验证该假设，本研究以金鱼为动物模型，采用多种实验方法，开展以下工作：1)检测kp及其受体(GPR54)与SL在垂体中的共表达分布规律；2）在原代培养的金鱼垂体细胞中，明确kisspeptin对SL基因转录、mRNA稳定性、蛋白合成与释放的调节；3) 揭示kisspeptin调控SL基因转录、蛋白合成与释放的胞内信号转导机制。本研究结果将为鱼类垂体SL表达调控机制和其在水产养殖中潜在的应用提供新的理论基础。

神经肽通过“下丘脑-垂体-靶腺”轴调控脊椎动物生长、生殖和能量代谢等重要生理活动。Kisspeptin是由KISS-1基因编码的肽类激素，它的受体是一种G蛋白偶联受体Kiss1r。最近，我们课题组以金鱼垂体原代培养细胞为模型证实：Kisspeptin可以直接作用于垂体并显著刺激生长激素(GH)、催乳素(PRL)和黄体生成素(LH)蛋白的释放。生长催乳素(SL)是由鱼类脑垂体中部细胞产生的一种糖蛋白多肽激素，结构与垂体产生的GH和PRL相似，属于GH/PRL超家族成员。当Kisspeptin/Kiss1r信号系统在鱼类垂体中证实存在后，我们考虑SL作为鱼类特有的垂体激素是否也受到Kisspeptin的调控。我们以金鱼为模式生物，首次从金鱼垂体分离、鉴定得到新型SL。序列分析表明：新克隆的SL基因属于鱼类SLa家族，与草鱼SLa基因相似度高达85%。通过构建3-D蛋白结构发现SLa蛋白三维结构同SLb家族具备高度保守的核心拓扑结构。以金鱼各个组织为实验材料，应用RT-PCR结合Southern-blot技术, 发现SLa基因在金鱼各个组织中广谱表达，在垂体组织中表达最高；而SLb基因只在垂体、肝脏和大脑中检测到表达。采用原位杂交和免疫组化技术，首次明确金鱼SLa和SLb在垂体水平的基因和蛋白表达图谱。此外，利用免疫组化实验结合显微切割分离细胞技术，首次证实Kisspeptin受体Kiss1ra和Kiss1rb基因专一表达于SLa细胞中，这一新发现为Kisspeptin调控SLa表达提供了理论依据。采用Real-time定量PCR和Western-blot技术，首次确认Kisspeptin显著上调SLa蛋白分泌，而对SLa基因表达无明显作用，并阐明Kisspeptin刺激SLa蛋白分泌主要通过 AC/cAMP/PKA 和 PLC/IP3/PKC 信号转导通路并激活下游Ca2+/CaM/CaMK-II。此外，我们研究发现神经内分泌因子生长抑制素-28(SS-28)可以通过激活生长抑素5 型受体抑制SLa和SLb基因表达。进一步，我们课题组首次在鱼类中克隆得到两个新型内分泌因子Irisin和Adropin，可以参与调控鱼类GH家族成员表达。我们的研究丰富了神经内分泌因子对鱼类垂体激素调控的分子机制和信号网络。

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