兔自体滑膜间充质干细胞修复重建半月板损伤的机制研究

半月板损伤治疗不当会导致膝关节退变，尽管异体移植、胶原半月板假体替代、细胞-支架重建等方法取得了一定效果，但是仍然没有很好的解决问题，我们在前期国家自然基金资助项目研究基础上，拟选择自体滑膜间充质干细胞作为种子细胞，在体外扩增培养，然后经TGF-β等细胞因子诱导向纤维软骨细胞转化，同时进一步优化细胞培养技术，促使其基质的分泌和合成，防止遗传表型的丢失。观察分析其生长发育特性；再将转化后的种子细胞种植于胶原支架上，观察细胞在胶原支架中的生长发育情况，最后植入体内原位修复重建半月板，选择不同时间点分别取材观察半月板在体内生长情况和对应软骨面磨损情况，采用组织学分析方法对重建的半月板进行分析，并与正常半月板组织进行对比。目的是寻找一种取材简单、扩增迅速的种子细胞。进一步研究TGF-β等细胞因子在促使向纤维软骨细胞分化时的作用和添加浓度、时间，及其促进Ⅰ型和Ⅱ型胶原的合成分泌机制。

目的：以经体外扩增及细胞因子诱导后已进入软骨细胞分化谱系的兔自体滑膜间充质干细胞(SMSCs)为种子，借助猪小肠粘膜下层（SIS）为支架，以SMSCs-SIS复合物的形式回植入兔体内半月板缺损处，探讨以此修复半月板损伤的可行性。.方法：通过有限稀释单克隆培养法将兔SMSCs由滑膜组织中分离出来并加以纯化，在体外用BMP-2、TGF-β3和DEX协同刺激SMSCs后，以RT-PCR，细胞免疫荧光化学染色，碱性甲苯胺蓝细胞化学染色判断是否能够诱导SMSCs进入软骨细胞分化谱系；经过预实验筛选后，使用L60（212）正交试验探索SMSCs向纤维软骨分化的充分必要条件，正交试验以纤维软骨生成率为因变量，使用RT-PCR方法检测纤维软骨细胞的基因表达，使用甲苯胺蓝等特异染色手段检测软骨特异性分子的表达。采用Abraham方法处理SIS；最后将经体外扩增及细胞因子诱导已进入软骨细胞分化谱系的SMSCs种植在SIS支架上，回植入体内，6周、12周后取修复组织块行HE染色，碱性甲苯胺蓝染色，I型、II型胶原与S100蛋白的免疫化学组织染色，探讨以此修复损伤半月板结构和功能的可行性。.结果：在体外培养条件下兔SMSCs的增生分裂能力十分活跃,在体外,SMSCs经BMP-2、TGF-β3和DEX协同诱导后14天，RT-PCR检测到I型、II型胶原及软骨特异性聚集蛋白聚糖（aggrecan）mRNA的表达，细胞免疫荧光化学染色也证实有I型、II型胶原的表达，同时碱性甲苯胺蓝细胞化学染色也证实有软骨细胞特异性胞外基质GAG成分，以上即证明SMSCs已进入软骨细胞分化谱系。正交试验结果表明在SMSCs成纤维软骨过程中TGFβ1，BMP7，ASA，bFGF，IGF是最重要的调控因子，通过对这些因子的剂量和时序表达的改变，可以显著的影响SMSCs成纤维软骨的过程。SMSCs-SIS复合物植入半月板缺损区12周后大体观察原半月板缺损区有半月板样组织生成，HE染色可见纤维软骨样结构，周围胶原纤维结构明显，排列规则；碱性甲苯胺蓝染色可见蓝色异染基质－GAG；I型胶原、II型胶原与S100蛋白的免疫化学组织染色呈强阳性。而胶原对照及空白对照组则仅见纤维组织样的修复组织。.结论：利用自体SMSCs经体外扩增及细胞因子刺激后，以SIS为支架，回植入半月板缺损区的方法，是一种较为可行的修复半月板损伤的方法。

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