基于功能化温敏聚合物和生物质谱的O-GlcNAc糖蛋白/糖肽富集、鉴定新方法研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
21405175
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
24.0万
负责人：
张万军
依托单位：
中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
学科分类：
B0403.谱学方法与理论
结题年份：
2017
批准年份：
2014
项目状态：
已结题
起止时间：
2015-01-01 至2017-12-31

项目参与者：
冯端；田芳；翟瑞；沈丙权；时照梅；马琳；吕雅瑶；张倩；
关键词：
生物质谱施陶丁格糖基化

项目摘要

O-GlcNAcylated proteins play important role in critical cellular physiological activity，such as stress responses and energy metabolism. However, the characteristics of O-GlcNAcylation face the challenges owing to low stoichiometric ratio, rapid cycling dynamics, and extremely lack of enrichment method. In this project, we will prepare thermosensitive polymer modified by novel scissionable staudinger reagent for efficient, highly selective, and reversible O-GlcNAcylated proteins/peptides enrichment from complex samples. The novel Staudinger reagent will not noly be used to selectively reversible release enrichment of O-GlcNAc-modified proteins/peptides for mass spectrometry(MS) identification, but also enhance its hydrophobicity results in remarkably increasing sensitivity and MS signal intensity. The thermosensitive polymer will achieve the enrichment procedure in homogeneous solution, which can avoid resistance to mass transfer, accelerate the reaction rate and significantly improve enrichment speed and efficiency, the established enrichment method, combined with bio-mass spectrometry, will be applied to identify O-GlcNAc modification sites in breast cancer, aiming at providing technical support for the research of anticancer drugs.

蛋白质O-GlcNAc修饰水平及位点的改变影响着细胞内几乎所有生理活动。然而以生物质谱为工具的O-GlcNAc修饰研究，仍然面临着修饰丰度低、动态变化、非修饰肽段干扰等问题，因此高效的富集方法成为O-GlcNAc修饰研究的关键。我们拟将新型Staudinger分子与温敏聚合物温度响应沉淀性质相结合，建立一种可以高效、稳定、可逆的对O-GlcNAc修饰富集鉴定的新方法。新型Staudinger分子不仅可以将富集到的O-GlcNAc修饰蛋白/肽段可逆释放用于位点鉴定，而且肽段疏水性的增强将显著改善其在质谱中的信号。以温敏聚合物作为富集基质，实现了在均相体系中对O-GlcNAc修饰蛋白/肽段的富集，显著降低固相载体富集的传质阻力与空间位阻，将大幅提高富集反应的速率和效率。该方法与生物质谱相结合，用于研究乳腺癌中O-GlcNAc修饰位点及表达量的改变，为研发新的抗癌药物提供技术支撑。

结项摘要

针对项目书中的四点研究目标，我们1）创新性地合成了具有超高水溶性的温度响应载体材料，建立了均相反应富集的新策略。他们通过调节富集体系的温度，可准确控制载体的溶解性：即富集时，载体完全溶解，与目标蛋白/肽段形成均相体系，降低富集反应的界面传质阻力，提高反应速率和富集效率。富集完成后改变体系温度可引发载体自组装，载体从溶液中完全沉淀，从而实现简单高效的样品回收。该温度敏感均相反应体系成功应用于在转录调控、营养代谢、信号转导、蛋白降解等生物过程中均发挥重要作用的O-GlcNAc修饰糖蛋白的富集，经质谱鉴定得到超过1700个可信度高的O-GlcNAc修饰蛋白，从而获得目前细胞水平研究中最大规模的O-GlcNAc数据集2）合成了一种新型的功能化温度敏感型聚合物PNIPAM-HRP-Staudinger，该聚合物对翻译后修饰蛋白的检测灵敏度放大超过100倍。结合体内代谢标记技术与蛋白印迹技术实现了对叠氮类生物分子的多级放大检测。对于项目计划书中描述的4点要求已经超额完成，项目执行期间还详细的考察了材料的物理性能、富集条件等，同时还利用功能性温度敏感型聚合物制备了“化学western”抗体，用于超灵敏检测叠氮标记的翻译后修饰蛋白。经过2015-2017三年实施，本项目进展顺利，已发表基金署名SCI收录论文6篇，其中Analytical Chemistry 2篇、Talanta 1篇、Anal Bioanal Chem 1篇、中国科学2篇；申请专利两三项，已授权一项，超额完成了项目计划书规定的指标。