黑曲霉中羟基化修饰莪术二酮P450酶的发现及功能研究

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    81602993
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    17.3万
  • 负责人：
    秦斌
  • 依托单位：
    沈阳药科大学
  • 学科分类：
    H3402.天然药物化学
  • 结题年份：
    2019
  • 批准年份：
    2016
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2017-01-01 至2019-12-31

项目摘要

Curdione is one of the main components in the clinically used essential oil of Rhizoma Curcumae. Through biological and chemical transformation of curdione and its stereoisomers by Aspergillus niger, we developed a library of lead compounds that contains 16 pairs of enantiomers. Moreover, in this library, the hydroxylated-curcumalactones that have unique structure and potential bioactivity could be derived further. To elucidate which P450s in A. niger were responsible for the hydroxylation and to prepare derivatives of curdione and curcumalactone with high activity and selectivity, in this project, we will perform ‘in-silico’ analysis of P450 in the genome of A. niger, transcription analysis of P450 in A. niger during hydroxylation, knock out of P450 in A. niger based on CRISPR/Cas9 and heterologous expression of P450 by Aspergillus oryzae. The discovery and functional analysis of P450 in A. niger will inspire the bioactivity research of molecules with curdione and curcumalactone skeletons. The methods used in this research will also give new insights into the functional analysis of genes in Aspergillus.
莪术二酮是临床用药莪术油中的关键活性成分，申请人在前期工作中，利用黑曲霉羟基化修饰莪术二酮及其立体异构体，结合化学转化制备了含有16对对映异构体的先导化合物库，该库中具有独特结构及潜在生物活性的羟基莪术内酯类化合物还具有进一步衍生的能力。为了阐明黑曲霉体内150余个P450中哪一个或者哪几个参与了羟基化修饰莪术二酮及其异构体，并实现高活性、高选择性地制备莪术二酮、莪术内酯类衍生物，申请人拟开展对黑曲霉基因组中P450的“in-silico”分析、黑曲霉羟基化修饰时体内P450的转录分析、基于CRISPR/Cas9技术对黑曲霉中相关P450的敲除以及P450基因在米曲霉中异源表达。通过这四部分内容的研究，发现黑曲霉中参与羟基化修饰莪术二酮及其异构体的P450，并对其功能进行分析。本项目能够为莪术二酮和莪术内酯类化合物的活性研究提供源头支持，也能够为曲霉中其它相关基因的研究提供新思路。

结项摘要

镜像关系的羟基化莪术二酮、莪术内酯是一类具有独特结构及潜在生物活性的药物先导化合物，为了高活性、高选择性地制备莪术二酮、莪术内酯类衍生物，申请人在本研究中首先希望通过寻找黑曲霉中的P450酶并研究其功能来实现目标。然而米曲霉异源表达系统中内源性的羟基化活性限制了该方案的进一步实施，为此申请人选择了具有高催化活性和广底物谱的P450BM3单加氧酶作为催化剂对莪术二酮及其异构体的羟基化修饰进行了进一步研究。通过利用微整形策略，即将活性腔中可能与底物存在相互作用的氨基酸分别替换成比其自身体积略大和略小的氨基酸来考察不同氨基酸对选择性的影响，并结合酶与底物之间存在的弱相互作用的分析来指导P450BM3突变体的设计，申请人仅经过一到三轮的突变，就获得了对莪术二酮及其异构体C2和C3位高区域选择性和立体选择性羟基化的P450BM3突变体，其中针对4个产物羟基化的选择性达到95%以上，3个羟基化产物的选择性达到90%以上。该研究中对莪术二酮的选择性羟基化修饰有望为该类化合物的开发提供源头支持，使用的策略也对P450酶及其它酶的蛋白质工程改造提供了一定的理论参照。

项目成果

期刊论文数量（4）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
Key sites insight on the stereoselectivity of four mined aldo-keto reductases toward alpha-keto esters and halogen-substituted acetophenones
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  • DOI：
    10.1007/s00253-019-09932-7
  • 发表时间：
    2019
  • 期刊：
    Applied Microbiology and Biotechnology
  • 影响因子：
    5
  • 作者：
    Zhang Wenhe;Zhu Tianhui;Li Hengyu;Qin Fengyu;Zhang Feiting;Zhang Rui;Jia Xian;Qin Bin;You Song
  • 通讯作者：
    You Song
Selective Oxidations of Cyperenoic Acid by Slightly Reshaping the Binding Pocket of Cytochrome P450 BM3
通过稍微重塑细胞色素 P450 BM3 的结合袋选择性氧化莎草烯酸
  • DOI：
    10.1002/cctc.201701088
  • 发表时间：
    2018-02
  • 期刊：
    ChemCatChem
  • 影响因子：
    4.5
  • 作者：
    Li Yuxin;Qin Bin;Li Xiaoqin;Tang Jun;Chen Yu;Zhou Lina;You Song
  • 通讯作者：
    You Song
Stereodivergent Synthesis of Carveol and Dihydrocarveol through Ketoreductases/Ene-Reductases Catalyzed Asymmetric Reduction
酮还原酶/烯还原酶催化不对称还原立体发散合成香芹醇和二氢香芹醇
  • DOI：
    10.1002/cctc.201801391
  • 发表时间：
    2018-12-07
  • 期刊：
    CHEMCATCHEM
  • 影响因子：
    4.5
  • 作者：
    Guo, Jiyang;Zhang, Rui;You, Song
  • 通讯作者：
    You, Song
Discovery of a Switch Between Prelog and Anti-Prelog Reduction toward Halogen-Substituted Acetophenones in Short-Chain Dehydrogenase/Reductases
短链脱氢酶/还原酶中卤素取代苯乙酮的前对数和反前对数还原之间的转换的发现
  • DOI：
    10.1021/acscatal.8b00807
  • 发表时间：
    2018-07-01
  • 期刊：
    ACS CATALYSIS
  • 影响因子：
    12.9
  • 作者：
    Qin, Fengyu;Qin, Bin;You, Song
  • 通讯作者：
    You, Song

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  • 作者：
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  • 通讯作者：
    盛光敏

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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