高活性苯并二吡咯类抗肿瘤抗生素的生物合成与新化合物挖掘

The benzodipyrrole natural products are novel antitumor antibiotics, including yatakemycin (YTM), CC-1065 and duocarmycins, which all possess highly potent cytotoxicity. The duocarmycin-derived antibody drug conjugate MDX-1203 has entered Phase I clinical trials for treating non-Hodgkin lymphoma and renal cell carcinoma. Our group has cloned the biosynthetic gene clusters (BGCs) of YTM and CC-1065, and elucidated the biosynthetic mechanism of the cyclopropyl pharmacophore and the self-resistance mechanism for the producers. Because these natural products are novel compounds, there are still many biosynthetic steps to be elucidated. For example, (1) our recent feeding experiments showed that the origin of the YTM backbone was different from that of CC-1065, so what is the precursor origin for YTM ? (2) The YTM structure indicates that there are four unique methylation steps, however, only two methyltransferases are encoded by the YTM cluster, so where are the rest ones ? (3) How is the sulfur atom incorporated into YTM ? Besides, there are many potential benzodipyrrole BGCs in the DNA databases, so what compounds do they encode ? If these scientific questions are resolved, it will be greatly helpful to engineer and harness these novel highly potent compounds, and also to supply a green sustainable source of new warhead molecules for antibody drug conjugates.

苯并二吡咯类天然产物是一种新型的抗肿瘤抗生素，包括谷田霉素（YTM）、CC-1065和多卡霉素，具有极高的细胞毒性活性。由多卡霉素发展的抗体药物偶联分子MDX-1203已进入临床Ⅰ期研究，治疗非霍奇金淋巴瘤和肾细胞癌。我们前期克隆了YTM和CC-1065的生物合成基因簇，阐明了药效团环丙基的酶催化过程和菌体的自抗性机制，但是还有许多重要的生物合成问题没有得到解决。例如，（1）喂养实验表明YTM骨架合成方式不同于CC-1065，那么YTM的骨架来源是什么？（2）YTM合成需要4种甲基化修饰，而其基因簇仅有2个甲基化酶基因，那么其他基因在哪里？（3）YTM的硫原子是如何参入的？此外，生物信息学分析发现DNA数据库有新的苯并二吡咯类化合物生物合成基因簇，那么它们编码的产物是什么？因此，本项目将致力于解决这些科学问题，为改造和利用这类高活性化合物和为抗体药物偶联分子研发提供更多的弹头分子奠定基础。

苯并二吡咯类天然产物是一种新型的抗肿瘤抗生素，目前成员包括谷田霉素（YTM）、CC-1065和多卡霉素，都具有极高的细胞毒性活性，因在抗体药物偶联分子研发中可作为潜在的弹头分子而具有重要的应用研究价值。我们前期克隆了YTM和CC-1065的生物合成基因簇，阐明了药效团环丙基的酶催化过程和菌体的自抗性机制，但是还有许多重要的生物合成步骤没有得到解决。此外，通过生物信息学分析发现DNA数据库中有新的苯并二吡咯类化合物生物合成基因簇，那么它们编码的产物是什么？在本项目实施过程中，我们通过不同同位素标记前体喂养发现YTM中苯并二吡咯的形成不经过莽草酸途径，也不通过聚酮合成途径，并且吡咯环来源于甘氨酸，也不同于胆色素原的形成，而苯环中仅有两对碳原子来源于葡萄糖的1、2位（或5、6位）；甲基和环丙基来源于甲硫氨酸中的甲基。这些实验结果暗示YTM中苯并二吡咯的模块组装模式完全不同于CC-1065的组装模式。但目前仍有若干碳原子的来源不清楚，还需要进一步深入研究。在本源菌株中激活基因簇的策略失败后，我们便通过异源表达策略挖掘苯并二吡咯类化合物。为了克隆相关基因簇，我们自主开发了基于CRISPR-Cas12a/TAR的大片段基因簇直接克隆技术（ACQUIRE），目前已利用此直接克隆技术成功克隆了SHJG_8481 - SHJG_8515，从而为接下来挖掘新的苯并二吡咯类化合物奠定坚实的基础。

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