基于转肽酶A介导的纳米抗体定向固定化策略的金黄色葡萄球菌肠毒素A高灵敏免疫层析检测研究

Staphylococcal enterotoxin A (SEA) is the highest food poisoning caused by bacteria in the world. Gold immunochromatographic assay (GICA) is an important screening method for SEA because of its simple and rapid advantages, but traditionally it has poor sensitivity and specificity due to the following reasons:1) The monoclonal antibody has a low affinity and its Fc-end is susceptible to binding to S. aureus surface protein A (spA) to produce false positive results. 2) Random orientation immobilization methods probably result in the loss of binding capability. For two reasons, this study intends to improve the sensitivity and specificity of the GICA method using nanobody (Nb) and its oriented immobilization strategy. First, nanobody against the surface antigens of SEA will be developed by llama immunized with SEA, and further analyze recognition domain with SEA. Secondly, the conserved LPETG motif, at which sortase A-catalyzed transpeptidation occurs, will be engineered at the C-terminal region of the nanobody against SEA. The recombinant nanobody can then subsequently be ligated to gold nanoparticle under sortase A catalysis. Furthermore, we will elucidate the influence of oriented immobilization strategy on recognition activity of probe and sensitivity of GICA. Finally, a highly sensitive GICA will be develop for the detection of SEA in food products. The research results will provide new research idea and theory for the development of efficient probe, and it will offer technical guarantee for the performance improvement of GICA in food safty.

由金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)引起的食物中毒在细菌性食物中毒中高居首位。胶体金免疫层析法(GICA)因简单快速是SEA重要的筛查法，但传统上该法因以下原因导致灵敏度及特异性较差：1)采用的单克隆抗体亲和力较低且其Fc端易与金黄色葡萄球菌表面蛋白A(spA)结合产生假阳性。2)抗体的非定向固定化导致探针表面抗体活性降低。基于此，本研究拟采用纳米抗体(Nb)及其定向固定化策略提升GICA法灵敏度和特异性。首先采用SEA免疫双峰驼制备高亲和力且不与spA结合的Nb并探析其识别位点；其次，在Nb的C端引入转肽酶A的识别位点，再通过转肽酶A介导的定向固定化策略制备高效探针，并对探针表面Nb的亲和力和结构进行分析，以阐明定向固定化提高Nb活性及GICA法灵敏度的理论基础；最后建立食品中SEA高性能GICA法。本研究为高效探针的研制提供新的思路和理论依据，为食品安全GICA法性能的提升提供技术支撑。

金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins, SEs）是由金黄色葡萄球菌分泌的毒性极强的蛋白，其中SEA、SEB和SEC在食品中最为常见，严重威胁人类健康。目前常用的以鼠源抗SEs单抗为识别元件的ELISA检测方法由于单抗会与SA表面的金黄色葡萄球菌蛋白A（SpA）高亲和力结合而产生假阳性结果，阻碍了该方法的发展。.首先分别以SEA、SEB和SEC免疫双峰驼，构建纳米抗体文库，通过生物淘选获得抗三种肠毒素纳米抗体，并进行亲和力测定。结果显示，经五轮免疫后，血清效价均达1:2,560,000以上，并构建了库容量约为107 cfu以上的纳米抗体文库，经三轮淘选，获得了抗SEA纳米抗体8株，抗SEB纳米抗体5株，抗SEC纳米抗体11株，形成了针对SEs的序列多样性抗体资源库，并探讨了SEA与纳米抗体的识别机制。.其次，在获得的纳米抗体基础上，建立免疫学检测方法。（1）构建了针对SEA的新型三纳米抗体免疫检测法：针对SEA有多组抗体具有较好配对效果，故以 A26 作为捕获抗体，以 A12 和 A150 作为检测抗体，构建三纳米抗体夹心ELISA法，其最低检测限为0.26 ng/mL，与传统夹心 ELISA 法相比，其灵敏度提高了约3.92倍。（2）构建了针对SEB的夹心ELISA 法：可用于建立夹心ELISA法的纳米抗体组合B7和B1，其平衡解离常数KD分别为4.5和7.9 nM。该方法线性检测范围为1~512 ng/mL，最低检测限为0.3 ng/mL。经特异性分析，该方法与SpA未见交叉。牛奶、脱脂牛奶、牛肉和奶酪的加标回收率为87.66%~111.40%。（3）构建了针对SEC的免疫学检测法：以 C6 为捕获抗体，C11 为检测抗体，建立了抗 SEC夹心ELISA法，定量范围为 4-250 ng/mL，最低检测限为 2.47 ng/mL。在乳制品中的回收率为84.52～108.06%。（4）探讨了定向固定化对免疫层析检测方法的影响。.本研究以纳米抗体为识别元件构建的免疫学检测方法，能避免与SpA结合导致的假阳性问题，可应用于实际食品中SEs的高灵敏检测，具有较好应用价值。发表学术论文 3 篇（第一标注），其中 SCI 收录论文 2 篇，申请发明专利 7 项，其中已授权3项，参加学术会议 2 次，培养博士1名，硕士2名。

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