细胞骨架蛋白WDR60参与神经管畸形发生的机制

Forward genetic screening is a highly efficient means to identify associated genes with human diseases. Previous studies commonly used Drosophila and zebrafish as animal models, but limited studies could be used for human diseases. We used pre-established PiggyBac (PB) transposon library of random mutant mice founded by our partners, screened neural tube defects (Neural Tube Defects, NTDs) phenotypes, and provided a lot of potential genes associated with NTDs. Wdr60, encoding cytoskeleton-associated protein, is a novel gene which we have received. The homozygous mutant mouse are embryonic lethal, showing encephalocele or scoliosis. We further detected WDR60 mutations in 100 cases of severe NTDs samples by use of the whole genome deep sequencing technology and found WDR60 showed high mutation frequency, with a total of 921 WDR60 mutations containing a frameshift mutation and four missense mutations. Above results suggested WDR60 mutations are highly correlated with NTDs. We intend to follow-up using the a fore-mentioned mutant mouse model to investigate the function of Wdr60 in neural tube development in mouse, screen the possible causative mutation in NTDs by use of molecular, biochemical and cellular functional assays, and verify its pathogenic role in human-derived WDR60 mutant knock-in mouse strains. Expected results could provide new candidate genes for NTDs gene diagnosis and gene therapy.

正向遗传学筛查是高效确定人类疾病表型相关基因的研究手段，既往多以果蝇和斑马鱼为模型，对人类疾病研究借鉴性较低。我们利用合作者前期建立的PiggyBac转座子随机突变小鼠库，对神经管畸形(NTD)进行正向遗传学筛查，为NTD遗传学研究提供大量潜在相关新基因。编码细胞骨架蛋白的Wdr60是我们获得的一个新基因，该基因纯合突变小鼠早期胚胎致死，表现为脑膨出等畸形。我们已对100例以无脑儿为主要表型的严重NTD样本进行全基因组测序，发现WDR60具有高突变率，共获得921个突变，含1个移码突变4个错义突变，提示WDR60与人NTD发生高度相关。我们拟利用前述小鼠模型探讨其对神经管发育的作用及机制；通过分子、细胞实验筛选在NTD 中的可能致病突变并在WDR60人源性突变敲入小鼠品系中验证其致病作用。预期成果将为NTD的基因诊断和治疗提供新的候选基因，并为出生缺陷新基因发现提供研究策略的借鉴。

出生缺陷是导致新生儿和婴儿发病和死亡的主要原因。神经管畸形(Neural Tube Defects,NTDs)和先天性心脏病(Congenital Heart Diseases,CHDs)都是高发病率的严重复杂出生缺陷。NTDs和CHDs发病模式多为散发, 很少累及家系多代人，呈多因素多基因的遗传模式，为研究其发病机制增加了困难。正向遗传学筛查是高效确定人类疾病表型相关基因的研究手段，我们利用合作者前期建立的PiggyBac转座子随机突变小鼠库，对NTDs和CHDs进行正向遗传学筛查，为两病的遗传学研究提供大量潜在相关新基因。编码细胞骨架蛋白的Wdr60和Wdr34是我们获得的新基因，Wdr60基因纯合突变小鼠早期胚胎致死，表现为脑膨出、心脏位置异常、完全性大血管转位等畸形。Wdr34基因纯合突变小鼠表现为尾部神经管闭合不全、心包水肿等畸形。我们通过对100例以无脑儿为主要表型的严重NTDs样本进行全基因组测序，发现WDR60和WDR34具有高突变率，WDR60含1个移码突变4个稀有错义突变，WDR34含4个稀有错义突变。其中WDR60 K191X突变和D1031N突变以及WDR34 G393S均影响了SHH 信号通路的传导。由于Wdr60基因突变的小鼠表现为心脏位置异常，我们收集了194个右位心的患儿，取血液抽取基因组DNA对其进行外显子测序，发现WDR60有9个稀有错义突变，且有5个突变影响基因本身的表达。通过对右位心样本的数据分析，我们发现右位心样本的单例功能丧失性变异(SLoFVs)明显高于对照，且突变富集在肿瘤小RNA(microRNA in cancer)信号通路，肝炎信号通路，肿瘤蛋白多糖信号通路,TGF-b信号通路。另外，我们也对417例CHDs病人进行了候选基因的测序，发现了2例AXIN2的病人特异新发突变，并发现L10F突变倾向于是功能丧失性突变，K132R突变是功能获得性突变，并在斑马鱼体内进行了验证，提示该基因突变对人类CHDs致病有贡献。综上所述，我们发现了WDR60和WDR34在神经管畸形、WDR60在心脏位置异常患儿、AXIN2在先天性心脏病的稀有错义突变并提示这些突变的可能致病贡献，将来为NTDs和CHDs的基因诊断和治疗提供新的候选基因，并为出生缺陷新基因发现提供研究策略的借鉴。

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