马疱疹病毒1型(EHV-1)神经致病因子UL24转录调控分子机制的研究

Neurological symptoms after infection of herpesvirus under certain conditions result from transcriptional regulation of UL24 by itself.This.program would target UL24 (ORF37)equine herpesvirus type 1(EHV-1), which could locate its promoter accuratly within the whole genome and clarify relevant mechanisms underlying transcriptional regulation of UL24 characterzied with double promoter, alternative poly(A) site and several temporal regulations.The core and regulatory elements constituting promoter would be confirmed via bioinformatics combined with 5'/3' RACE and screening system, and clearly define UL24 tanscription unit. Accordingly, we would probe into how the neighbourhood of genes affect UL24 transcription via qRT-PCR. Six regulatory proteins encoded by EHV-1 are IE (immediately early), ICP0/ICP22/ICP27/IR2 (early) and αTIF(late), respectively.We would construct their eukaryotic expression vectors seperately,and confirm which one or groups could exert influence over UL24 transcription directly post transfection of the RK-13 cell lines. The program would put forth a novel idea in this research field, which could provide experimental basis and theoretical clues to future research involved in herpesviruses' neuropathogenicity.

EHV-1调节蛋白(IE、IR2、ICP0、ICP22、ICP27、αTIF)协作调控该病毒所有基因转录启始及频率是EHV-1生物合成和精确装配的先决条件。神经致病因子UL24双位点起始、双poly(A)位点修饰和多时程的转录模式与EHV-1神经系统潜伏感染和病毒组装紧密相关，然而UL24转录调控机理至今未被揭示。我们前期工作定位了UL24启动子区域和转录起始位点。本项目将利用Northern blot和3’RACE确认不同转录时程UL24基因poly(A)位点的具体位置以及基因组复制状态对转录模式的影响。拟以荧光素酶实验方法结合qRT-PCR，确认调节蛋白调控UL24启动子和poly(A)位点的功能及协作方式；探究UL24及其相邻蛋白(UL25和TK) 调控转录的潜能性。本项目的立项将阐明UL24转录调控机理，同时发现EHV-1调节蛋白更多调控机制，为后续基础研究提供参考系统和共享平台。

本项目以马疱疹病毒1型（EHV-1）神经致病因子UL24转录表达的调控机制为研究内容。UL24转录起始于两个起始位点，受到两个启动子的控制：UL24I和UL24II-5。UL24I是TATA box依赖型的启动子，后者则相反，UL24II-5仅依赖于GC box和Initiator（起始子）；UL24I也受到GC box的调控。UL24是疱疹病毒目的核心蛋白，不同病毒之间的UL24蛋白的结构相似度很高，属于保守型蛋白。本项目，对比HSV-1和EHV-1 UL24启动子序列，发现前者启动子序列以及相关顺式元件都具有相当的一致性，预示其调控机制也具有相当的一致性。然而，在本项目未开展之前，EHV-1调控蛋白对其调控功能及机制，未有研究。本项目分别表达了6种调控蛋白:IEP/IR2P/EICP0/EICP22/EICP27/ETIF, 与UL24启动子报告质粒共转染RK13细胞，明确了IR2P能够明显降低UL24启动子的活性；EICP27对两个启动子均无调控作用；EICP0，EICP27和ETIF对二者均有正调控功能。而且，UL24蛋白本身对其自身启动子也有正调控作用，无论TATA box是否存在。由此，本项目将UL24蛋白正调控功能拓展到其他类型的EHV-1启动子：PTK，PIE，PgK，PIR5，以及异源启动子PCMV和PSV40，但其机理还有待于进一步探究。UL24蛋白属于PD-(D/E)XK磷酸二酯酶超家族，其关键氨基酸均位于5’端，对UL24正调控功能均存在不同程度的影响。经过CO-IP分析，宿主蛋白TBP能够与UL24（EHV-1/HSV-1）相互作用。宿主蛋白NPM1能够逆转UL24正调控基因转录功能，NPM1也能够免疫共沉淀UL24（EHV-1/HSV-1）。本项目，不仅基本完成了申请书的既定目标，也开启了一个新的研究命题——UL24新型生物学功能及生物学意义的研究。

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