狼毒大戟中蓖麻烯型二萜从简单环状骨架向复杂环状骨架的转化过程及其代谢工程菌的建立

The main bioactive constituents of TCM herb Euphorbia fischeriana are casbene-type diterpenoids including tigliane and ingenane subfamilies. Among these compounds, prostratin (tigliane-type) was approved by FDA as an anti-AIDS drug candidate in clinical trial, and ingenol derivatives possess the same core structure as the anticancer drug ingenolmebutate. To address the problems of low contents in planta and low synthetic yields of these compounds, the applicant will study their biosynthesis. The applicant cloned a casbene synthase (CS), two cytochrome P450 CYP726A enzymes and a short-chain alcohol dehydrogenase, identified the function of CS and constructed engineering strains of producing casbene; documented that the genome of E.fischeriana possesses the biosynthetic gene cluster of casbene-type diterpenoids and its size is 388.95 Mb. Based on these results, the applicant will ① construct and screen Bacterial ArtificialChromosome of E.fischeriana to identify the target cluster, ② clarify key biosynthetic steps involving conversion of casbene to complex cyclic skeletons (e.g. tigliane and ingenane), ③reveal cryptic biosynthetic pathway from tigliane-type diterpenoids to daphnane-type diterpenoids and ④ construct engineering strains of producing key biosynthetic intermediates to pave the way for establishment of synthetic biology systems for industrially producing these comounds.

目前，从野生中药植物狼毒大戟中发现的蓖麻烯型二萜包括巴豆二萜烷和巨大戟烷两种亚型。针对其中先导化合物巨大戟醇（巨大戟烷亚型）和候选药物prostratin（巴豆二萜烷亚型）含量甚微并且化学合成收率低的问题，本项目拟开展其生物合成方面的研究。申请人在前期研究中，克隆了蓖麻烯合成酶（CS）等蓖麻烯型二萜生物合成相关酶，并构建了产生蓖麻烯的工程菌；采用长距离PCR技术证明狼毒大戟基因组含有蓖麻烯型二萜的生物合成基因簇；确定该基因组为388.95 Mb。以此为依据和基础，拟通过建立和筛选狼毒大戟细菌人工染色体的方法，① 鉴定蓖麻烯型二萜的生物合成基因簇，② 阐明从蓖麻烯向巴豆二萜烷和巨大戟烷等复杂多环骨架转化的关键步骤，③ 揭示隐秘的从巴豆二萜烷亚型成分到瑞香烷亚型成分的代谢途径，④ 并构建产生重要中间体的工程菌，为实现合成生物学技术对prostratin等化合物的规模化生产奠定基础。

狼毒大戟是中药狼毒的基原植物之一。该植物富含多种骨架类型的蓖麻烯衍生二萜，包括千金烷型、巴豆烷型、巨大戟烷型和瑞香烷型，这些化合物表现出很高的药用价值。其中，巨大戟醇的延胡索酯（Ingenol mebutate）为上市抗癌药物，prostratin为已上临床研究的抗HIV候选药物。这些化合物含量低，且结构复杂、合成难度大，因此生物合成是解决其规模化获取的有效手段。本项目，首先对狼毒大戟中的二萜类化合物进行系统的分离鉴定，获得28个二萜化合物。通过分析这些化合物的结构变化，推测化合物的生物合成过程。通过建立和筛选狼毒大戟的细菌人工染色体文库，结合转录组测序，鉴定了一个蓖麻烯合成酶EfCBS、15个细胞色素P450酶和5个短链醇脱氢酶。采用体外酶反应实验以及合成生物学手段，表征了蓖麻烯合成酶以及两个细胞色素P450酶的功能。其中细胞色素P450酶EfCYP50负责蓖麻烯C-5和C-6位的氧化，而细胞色素P450酶EfCYP38负责蓖麻烯C-9的氧化。当把EfCBS、EfCYP50和EfCYP38同时表达在工程酵母菌H2（其萜类化合物生物合成途径已被优化），可产生千金烷型二萜，从而揭示了蓖麻烯向三环体系千金烷型二萜骨架的转化机制。因此，该项目不仅表征了负责千金烷型二萜骨架形成的两个细胞色素P450酶，同时也建立了千金烷型二萜的工程菌。这样为进一步阐明巴豆烷型、巨大戟烷型和瑞香烷型二萜的生物合成并建立相应化合物的工程菌奠定了重要基础。

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