基于磁性纳米粒子磁信号放大全血中循环肿瘤细胞高效分离新方法的研究

Accurate diagnosis of cancer in its early stage can help to control the cancer and thus prolong the survival of cancer patients. Circulating tumor cells (CTCs) presented in peripheral blood can predict early stage cancer, rapid and high specific magnetic separation of CTCs is meaningful both theoretically and practically. In our previous study, we have successfully enriched CTCs from fresh whole blood using 30 nm magnetic nanocrystals, however, the separation time was too long and the magnetic gradient used for separation was too high. In the present project, following research work were proposed in order to solve the time and magnetic gradient issue. 1. Biocompatible modification and surface charge control will be performed in the proposed research, both zeta potential and repulsive force will be decreased after above modifications. 2. Magnetic signals will be amplified using streptavidin and biotin interactions, and magnetic nanocrystals in diameters of 30, 60, and 100 nm will be discussed for their behaviors how they affect the CTCs separation in whole blood. Our final goal is to separate CTCs in whole blood in 30 min with magnetic gradient of 30 T/m, proving new approaches and basis for early stage cancer diagnosis.

癌症的早期精确诊断是癌症控制及延长癌症患者寿命的有效途径。外周血中的循环肿瘤细胞（CTCs）可用来预示早期癌症，建立其高效、特异性磁分离方法具有重要的理论探索价值。在前期工作中，申请人利用磁性纳米粒子（30 nm）实现了全血中痕量CTCs的高效富集，然而存在分离时间过长、所需磁场梯度较高等问题。为此，本项目拟：1、采用兼容性分子修饰技术和表面电荷控制技术，通过降低磁性纳米粒子表面电势、减少磁细胞分离时的斥力，以缩短癌细胞分离时间；2、利用链霉亲和素（SA）和生物素（Biotin）体系，探讨不同粒径（30 nm，60 nm，100 nm）磁性纳米粒子分离全血中CTCs时磁信号级联放大行为，实现低梯度磁场下（小于30 T/m）全血中CTCs特异性快速分离。预期研究结果将为利用磁性纳米粒子实现早期癌细胞的快速诊断提供新思路和科学依据。

磁分离技术是CTCs富集分离的一种重要方法。为了探究不同粒径的磁珠经磁信号放大对CTCs富集分离的影响，合成了25 nm、150 nm和1 μm三种粒径的链霉亲和素修饰的磁珠（MPs-SA）。以乳腺癌MCF-7细胞作为目的CTCs细胞，结果表明基于生物素-链霉亲和素放大体系（BAS），25 nm磁珠优于150 nm和1 μm磁珠，更有助于MCF-7细胞的富集分离。当MP25nm-SA用量为60 μg时MCF-7细胞的分离效率为81.6%，即使MCF-7浓度较低时（约20个细胞/mL），25 nm的磁珠仍能实现CTCs高效的富集，且富集分离得到的细胞具有较高的活性，可直接进行培养。培养24 h可观察到细胞的分裂增殖，这对于肿瘤转移机制、肿瘤的治疗等的研究具有重要的意义。研究也尝试寻找新的靶向分子以替代抗体来实现对CTCs的分离检测。研究中FA-PEG被直修饰在25 nm磁珠的表面用于富集分离全血中FR过表达的SKOV3细胞，平均分离效率达到了61.3%，且富集分离得到的细胞仍保持完整的结构。结果表明FA修饰的磁性纳米粒子可实现对全血中SKOV3细胞的无损伤富集分离检测。然而，用该方法对10个临床样本进行检测时，仅从5个血液样品中检测到CTCs。为了进一步提高检测的灵敏度，研究中采用牛血清蛋白（BSA）作为靶向分子载体，基于BAS放大体系，利用BSA介导的多价结合方式实现磁信号放大对血液加标样本中SKOV3进行富集分离。研究结果表明该方法能高效富集分离全血中SKOV3细胞，分离效率高达91±4.7%，将其用于20位临床卵巢癌患者血液中CTCs的检测，成功地从16位患者的血液中检测出不等数目的CTCs（1-31个），而未从100个健康的血液中检测出CTCs。表明该方法具有临床应用的能力，为CTCs的临床检测提供新的参考。综上所述，本项目研究了基于磁性纳米粒子磁信号放大全血中循环肿瘤细胞高效分离的新方法，阐述了应用磁信号放大进行CTCs分离的相关机制和与分离效率的关系，为该方法的在临床检验中的实际应用奠定了基础。

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