人类配子、早期胚胎印记基因DNA甲基化缺陷与辅助生殖技术结局相关性的研究

Many studies revealed that the assisted reproductive technology(ART) may be related to aberrant DNA methylation of imprinted genes, resulting in abnormal growth and development. However, the conclusions were mainly inferred from the hypothesis of animal studies,and related human studies are limited. Our previous studies established the technique to examine the DNA methylation in single oocyte and single embryo; primarily investigated the aberrant DNA methylation of imprinted genes during ART procedure. In this study, we plan to trace the human gametes, early embryos, villus and offsprings, use the combined bisulfite restrictionan alysis (COBRA), bisulfite sequencing PCR (BSP) and pyrosequencing to examine their DNA methylation status of multiple imprined loci. Meanwhile we collect the corresponding data regarding fertiliztion, embryo development, pregnancy and spontaneous abortion for comprehensive analysis .We try to explain the general risks of abnormal methylation occurrence and epigenetic inheritance linked to ART; reveal the relationship between methylation defects and ART outcomes, providing more evidence for evaluating ART safety.

多数研究认为辅助生殖技术与印记基因DNA甲基化缺陷相关，可能导致生长发育异常，但研究结论多根据动物实验推断，相关的人类研究较为局限。我们的前期研究建立了人类单个卵细胞、单个胚胎的DNA甲基化检测技术，初步探索了与辅助生殖技术相关的印记基因甲基化缺陷的现象。本项目拟以辅助生殖流程中获得的配子、早期胚胎、绒毛和出生子代为对象，采用结合重亚硫酸盐限制性酶分析（COBRA）、重亚硫酸盐测序（BSP）、焦磷酸测序（pyrosequencing）等技术跟踪检测多个印记基因DNA甲基化状态，同时收集相应的受精、胚胎发育、妊娠、自然流产等相关数据，通过综合统计比较，阐明辅助生殖技术操作流程中印记基因甲基化缺陷的发生和传递的总体风险，揭示印记基因甲基化缺陷与辅助生殖结局的相关性，为进一步评价人类辅助生殖技术的安全性提供更多的科学依据。

辅助生殖技术是否与印记基因DNA甲基化缺陷相关一直是研究的热点。本项目从表观遗传角度出发, 通过对配子、胚胎、和出生子代印记基因DNA甲基化的研究，初步阐明了体外补救成熟、低温冷冻等技术操作流程中印记基因甲基化缺陷的发生和传递的总体风险，为进一步评价辅助生殖技术的安全性提供有益的信息。主要研究内容和结果：（1）卵细胞体外补救成熟技术的表观遗传学风险：研究未成熟卵细胞在体外补救成熟后，印记基因H19和PEG1的DNA甲基化状态，发现21.7%的补救成熟卵细胞出现H19异常高甲基化模式，提示使用补救成熟的卵细胞可能会增加胚胎或子代甲基化缺陷的风险；（2）低温冷冻对胚胎基因印记的影响：收集人类第3天（Day3）冷冻胚胎和新鲜未冷冻胚胎，检测并比较印记基因H19的DNA甲基化状态。发现三种类型胚胎的异常甲基化发生率无显著差别。提示冷冻操作可能并不增加胚胎甲基化异常的发生率，但冷冻胚胎的甲基化异常率有增高的趋势;（3）人类精子与受精后早期胚胎印记基因DNA甲基化：选择治疗中废弃或剩余的精子和胚胎为研究对象，检测并分析印记基因H19和PEG1的DNA甲基化状态，发现少、弱精子症的男性患者精子DNA甲基化有较高的异常率，通过ICSI技术辅助受精后，胚胎质量不佳，且印记基因甲基化异常率显著增高。由于ICSI技术将精子直接注射到卵母细胞内，避开了人类自然妊娠时精子的自然选择过程，提示ICSI技术对子代远期的安全性应引起重视；（4）精子印记基因DNA甲基化异常与后代印记基因甲基化的对应关系：发现一例患者精子存在H19甲基化异常，通过人工授精技术出生的后代，检测其H19基因，并未发现异常。提示精液中并非所有的精子细胞都存在相同的甲基化状态，由于检测技术的局限性，不能发现少数精子的甲基化状态。虽然患者精液检测呈现异常甲基化状态，但有可能其中少数的精子细胞是正常的，且孕育的后代亦为正常。总体而言，辅助生殖技术中的很多环节，如体外补救成熟、低温冷冻等，均在微观分子水平增加了印记基因甲基化异常的几率；不孕症患者的遗传学背景是一个需要重视的因素，其本身可能携带印记基因甲基化异常，且增加受精后早期胚胎的甲基化异常几率。人体在细胞和分子水平有非常复杂的作用机制，需要更长期且深入的研究才能全面、客观的评价辅助生殖技术的安全性

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