snthr-1Bao小鼠稀毛调节基因的QTL精细定位及克隆鉴定

snthr-1Bao是申请人通过ENU诱变获得的突变种稀毛小鼠（D2背景），其突变基因已被定位且鉴定为Plcd1缺失。在突变基因定位过程中，申请人发现存在着能够改变F2小鼠[（snthr-1Bao×B6）F1互交]稀毛表型的调节基因。于是采用QTL定位策略首次发现了小鼠第2、5、7、15号染色体存在与毛发稀疏相关的基因座。本项目围绕最终鉴定调节基因的研究目标，在培育4个调节基因导入系小鼠验证QTL效应的基础上，继续采用QTL定位策略缩小调节基因范围，并进一步采用单体型分析、QPCR、信号通路追踪等多种策略筛查候选的调节基因，最后测序鉴定调节基因在不同品系小鼠的碱基差异并初步研究它们在皮肤的定位及表达。本项目争取克隆1到2个与毛发稀疏相关的基因，这对Plcd1及其调节基因的功能研究、毛发稀疏分子机制的研究以及皮毛类经济动物的育种具有重要的科学意义。

snthr-1Bao是Plcd1缺失引起的稀毛小鼠，前期工作发现B6基因组上存在Plcd1的修饰基因，这些基因位于第2、5、7、15号染色体特定区域。本实验针对已发现的4个调节位点，采用微卫星作为标记，通过反复10代回交将特定的B6小鼠基因组片段导入snthr-1Bao稀毛小鼠，成功培育出4种修饰基因导入系小鼠，其中Snthr.B6-CH2，Snthr.B6-CH5被毛缺失加重，Snthr.B6-CH7，Snthr.B6-CH15被毛缺失减轻。随后，分析PLCD1信号过程及比对基因组序列，筛选出plcd1 15号染色体上的修饰基因Celsr1，经鉴定为mRNA 5710 C→A及7577 A→G变异，该变异分别引起了AA 1901H→Q及2524T→A的改变，进而显著影响PLCD1的二级结构。与此同时，课题组收集了在皮肤表达的176个关键基因，设计引物，验证特异性，将引物按使用浓度交联到96孔PCR反应板中，经反复优化制成了2块皮肤表达关键基因QPCR芯片，每块芯片包含88个目标基因、6个参比基因、1个PCR 阳性对照和1个基因组DNA对照。随后，课题组采用该芯片检测snthr-1Bao小鼠在毛囊发育阶段的基因表达，发现了13个差异表达基因（标准为Fold>=2，p<=0.05）： Cyp4f15、Itga1、Hgf、Msx2、Cyp26c1、Wnt7a、hprt、Crabp1、Rbp1、Crisp1、Odc1、Fgf7和Lrat；这些差异表达基因涉及Pathways in cancer、Retinol metabolism、Melanoma、TGF-beta signaling pathway和Cytokine-cytokine receptor interaction五条信号通路。在此基础上，实验室采用原位杂交法对相关基因的表达进行研究，已制备了8个基因的探针，相关工作待进一步开展。本实验不仅培育了4个snthr-1Bao的基因导入系小鼠，鉴定了15号染色体上修饰基因Celsr1，还制备了含有176个皮肤表达关键基因的QPCR芯片，并采用该技术研究了相关小鼠的病理发育，发现了13个差异表达基因。本项目的完成为被毛稀疏的机制研究提供了新的思路、材料及线索。

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