基于iTRAQ技术研究牛分枝杆菌诱导下巨噬细胞胞内蛋白及信号通路的作用机制

Mycobacterium tuberculosis(M.tb) is pathogenic bacteria of tuberculosis, which is a typical intracellular parasitic bacteria. M.tb usually locates in macrophage when it infect the host. And macrophage is the first barricade to body defense system.On one hand, macrophage plays an important role to defend M.tb,on the other hand , macrophage can be the main location for the persistence and potential infection of M.tb. Interaction between macrophage and M.tb acts as most important role to occurrence and development of tuberculosis. In this study, we use RAW264.7 as an vitro macrophage model stimulated by Mycobacterium bovis (M. bovis) with different virulence. And iTRAQ technology will be applied mainly to analyze macrophage survival , cellular polarization, main cytokine’s production and its effect regularity, characteristic of endocelluar protein and apoptosis of macrophage, change regularity of signal pathway. The study will establish the base to explore completely in the fields of change regularity of inner macrophage proteins components, pathogenic mechanism of M.tb, mechanism of anti-infection and apoptosis of macrophage by means of methods involved in cell biology, molecular biology, immunology, proteomics. The important significance of the study focuses on demonstrating effect regularity of macrophage inner protein and cytokines, mechanism of signal pathway of macrophage and anti-infection of M. bovis.

结核分枝杆菌(M.tb) 为结核病的病原菌，是典型的细胞内寄生菌。分枝杆菌感染宿主后，主要定居于巨噬细胞内。巨噬细胞是机体防御系统的第一道屏障，一方面发挥着抵抗结核分枝杆菌的作用，另一方面又是结核分枝杆菌体内滞留、造成潜伏感染的主要场所。巨噬细胞与结核分枝杆菌的相互作用对结核病的发生、发展起着非常重要的作用。本研究采用蛋白质组学iTRAQ技术，以不同毒力牛分枝杆菌(M.bovis)菌株感染后的小鼠巨噬细胞RAW264.7作为体外细胞模型，对巨噬细胞的存活、细胞的极化特点、主要细胞因子产生及其作用规律、胞内蛋白、细胞凋亡特点及信号通路变化规律等方面进行分析。本研究从细胞生物学、蛋白质组学等层面展开研究，为全面探究巨噬细胞蛋白组分的变化规律、牛分枝杆菌致病机理、巨噬细胞的抗感染机制及其凋亡规律奠定了基础。在阐释巨噬细胞胞内蛋白及细胞因子作用规律、信号通路作用机制等方面具有重要意义。

在巨噬细胞与牛分枝杆菌互作的过程中，宿主细胞多种免疫机制发挥着重要作用，其中就包括组蛋白的乙酰化调节。因此，本研究通过探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对THP-1巨噬细胞和C57BL/6小鼠抵抗牛分枝杆菌感染的影响。结果显示牛分枝杆菌感染后，丁酸钠能够促进THP-1细胞LL37的表达，增强THP-1细胞清除胞内牛分枝杆菌。在给C57BL/6小鼠注射丁酸钠后，受感染的小鼠存活率升高，肺内细菌负担比未注射丁酸钠组减少。这一结果证实组蛋白的乙酰化调节能够影响机体对牛分枝杆菌的抵抗作用，为抗结核新药研发提供了思路。.本研究通过卡介苗（BCG）感染RAW264.7小鼠巨噬细胞，设计合成VDAC1的小干扰RNA（Si-VDAC1）并验证抑制其表达，然后采用Western blot、免疫荧光、Real Time-PCR和流式细胞术等实验技术，探讨VDAC1对RAW264.7细胞凋亡的调控作用；通过VDAC1抑制剂VBIT-4阻断VDAC1寡聚作用，研究在BCG感染巨噬细胞时，VDAC1参与调控RAW264.7细胞凋亡的调控作用机制。本研究结果显示：BCG感染能够引起巨噬细胞发生凋亡并导致VDAC1表达上调，敲低VDAC1后能够降低内源性凋亡相关基因和蛋白的表达，并减少细胞凋亡率，且VBIT-4通过抑制VDAC1寡聚体的形成降低了VDAC1介导的细胞凋亡。结果表明VDAC1通过寡聚作用参与了BCG感染RAW264.7细胞凋亡的调控。.本研究通过基因测序比对和蛋白组学的方法，以探究不同牛分枝杆菌的毒力差异和致病性相关因素。通过致病性不同的两株牛分枝杆菌M. bovis N、C68004与中国某地区66株临床分离株的10个毒力基因测序和比对分析。结果显示66株临床分离菌的10个毒力基因变化规律与N菌高度一致并且具有高度遗传相似性，反映了N菌在牛群中的适应性较强。为了研究牛分枝杆菌M. bovis N和C68004菌株间蛋白水平的差异表达，采用定量蛋白组学分析的方法对两个菌株进行鉴定。结果显示，随着临床用药频繁和免疫应答的改变，N菌在适应环境过程中，毒力基因发生了变异，并且与代谢、DNA复制以及耐药相关的蛋白表达也出现差异。

内容获取失败，请点击重试