基于环状DNA复制法介导的抗肿瘤活性聚酮violaceoids及其类似物的合成生物学研究

Natural products have been a rich source of compounds for drug discovery throughout human history, but the search for novel compounds using conventional methods is becoming more and more difficult. On the other hand, genome sequences of many microorganisms indicate that they have the potential to produce many more molecules than previously expected. Furthermore, recent advances in genome sequencing technologies have allowed rapid access to diverse microbial genomic data. Taken together, novel natural products should still be obtained by utilizing the biosynthetic potential of microorganisms in an appropriate approach..This project aims to establish a way to construct fungal transformation vectors with a variety of combinations of biosynthetic genes and thus to generate diverse artificial biosynthetic pathways, with the aid of the recently developed replication-cycle reaction (RCR) method. This methodology will provide an innovative way to create artificial metabolisms, which can theoretically be applied to any types of natural product biosynthesis. To investigate the usefulness of the methodology, this project will focus on the fungal antitumor polyketides violaceoids and structurally related but somewhat different natural products and perform structural derivatization of these compounds in a genomics-driven manner, which will provide a series of new natural product analogues with potential biological activities..Collectively, this project will provide not only a comprehensive image of the biosynthesis of violaceoids and their related natural products and enzymes responsible for chemically intriguing reactions but also a new methodology in which we can utilize accumulating genomic data to synthesize useful molecules.

传统策略发现全新天然产物越来越困难，后基因组时代，基因组导向挖掘策略或可解决这一难题。然而，面对海量基因组信息，如何开发新的基因组挖掘工具是几乎所有天然产物研究者都关心的话题。我们前期借助于米曲霉异源表达体系成功地揭示了10多个复杂天然产物的生物合成途径并发现了大量功能新颖的酶。为此，我们提出假说，米曲霉宿主结合环状DNA复制法（RCR）介导的合成生物学策略或可成为一个有效的研究真菌来源活性天然产物生物合成及合成生物学工具。为了验证这一假说，本项目首次以抗肿瘤聚酮化合物violaceoids为研究对象，利用米曲霉宿主结合RCR法介导的合成生物学体系，尝试揭示此类化合物独特生物合成机制的同时，体外重构该化合物及其类似物生物合成途径，创造更多结构全新的天然产物。本项目将以合成生物学策略揭示并重构真菌来源天然产物生物合成途径，挖掘全新天然产物这个新视点，为天然产物基因组导向挖掘提供新的研究思路。

天然产物一直都是创新药物研发的源泉，建立和开发全新方法发现新活性天然产物迫在眉睫，尤其是开发新的基因组导向挖掘和生物技术方法。本项目旨在阐明真菌聚酮violaceoid及其类似天然产物的生物合成机制的同时，设计合理的新方法对真菌来源天然产物进行基因组挖掘。同时，我们拟建立一种新的真菌转化方法，使几乎任何真菌生物合成基因簇都能高效异源表达。.在项目资助下，我们1)部分阐明了violaceoid、及其类似物varitriol的生物合成途径，同时对于此类化合物聚酮合酶的结构域功能进行了深入诠释; 2)通过分析violaceoid原产菌株的代谢产物，以及在该类化合物聚酮合酶的指引下，我们发现了一种新的聚酮非核糖体肽杂合物pyranoviolin A; 3)我们还对另一种真菌PKS进行了表征，并发现PKS的起始单元酰基转移酶（SAT）结构域不寻常地负责聚酮和氨基酸之间酯键的形成。在真菌转化方面，我们建立了一种利用CRISPR-Cas9系统介导的体内同源重组新方法，该方法可以结合两个或多个DNA片段。通过应用这一策略，我们在一次转化子中成功地将一个~30 kb的非核糖体肽合成酶（NRPS）基因导入米曲霉异源宿主。项目已经在美国化学会志JACS、微生物前言等期刊发表学术期刊，同时，申请人还在NSFC-RGC化学生物学前沿与挑战青年学者论坛、第15届亚洲前沿有机化学国际会议（ICCEOCA-15）和第2届JNU UTokyo天然产物生物合成联合研讨会上进行了受邀演讲或海报展示。.总之，在本项目的资助下，我们不仅完成了预期目标，并且开发了全新的真菌异源表达技术并用于真菌生物合成基因簇的异源表达，同时促进了整个天然产物基因组挖掘工作，以期更为高效、快捷的发现全新真菌来源天然产物。

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