RFRP-3对哺乳动物卵泡发育的影响及作用机制研究

Previous studies have showed that GnIH (gonadotropin-inhibitory hormone) secreted by hypothalamus can exert their function in inhibitting gonadotropin production in birds, and RFRP-3 is generally accepted to be the mammal's GnIH. Our experimental results also have acknowledged expression of the RFRP-3 receptors on the ovaries of the mice before and after birth as well as an increase of the litter size after immunization with the RFRP-3 gene vaccine. The above information endows us with an updated view of the physiological role of RFRP-3 in the control of mammalian reproduction. Therefore, in the present project studies, by using many kinds of experimental technologies such as immunohistochemical technique, chromatin immune precipitation (CHIP), dual luciferase report plasmid construct, flow cytometric classification, fluorogenic quantitative PCR, Western blot and radioimmunoassay, the regulatory mechansim of RFRP-3 on the genes and sigal paths related to both primordial follicles and primary ones will be clarified. Moreover, many research contents including phosphorylation of ERK1/2, p38 and JNK, expression of apoptosis-inducing receptors (FasL/Fas), content of cAMP/cGMP, activity of GPR3 or GPR12 or PDE3A and concentration of reproductive hormones will be adopted for expounding the tissue-specific function of RFRP-3 on the antral follicles. The main purposes lie in the following two aspects: ① Clarify the regulatory mechanism of RFRP-3 on follicle development of the mammals from the molecular and cellular levels. ② Produce a new hormone gene vaccine, further promoting development and application of gene immunization technology in animal husbandry.

象鸟类GnIH一样，哺乳动物RFRP-3能从下丘脑和垂体水平间接抑制促性腺激素分泌。我们前期研究也发现，RFRP-3受体能在出生前后小鼠卵巢表达， RFRP-3基因疫苗免疫小鼠能提高产仔数。以此为切入点，本项目以小鼠为动物模型，采用荧光免疫组化、CHIP实验、双荧光素酶报告质粒构建、流式细胞分类、荧光定量PCR、Western blot和放射免疫测定等技术，不仅分析RFRP-3与卵巢早期发育有关基因和信号通路的关系，而且从ERK1/2、p38和JNK磷酸化，FasL/Fas和cFLIPS/L表达，cAMP和cGMP水平，GPR3、GPR12和PDE3A活性以及激素分泌等方面分析RFRP-3对有腔卵泡的组织特异性作用，旨在：①从性腺水平阐明RFRP-3对哺乳动物卵泡发育的直接作用及机理；②开发新的激素基因疫苗，进一步推动激素基因免疫技术发展和在动物生产中的应用。

促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibiting hormone，GnIH）可以抑制性腺类激素的合成与释放。RFRP-3为GnIH同系物，抑制GnRH的分泌，GnIH可以代表哺乳动物RFRP-3。本项目通过对GnIH的理化性质、亲（疏）水性、信号肽位点、二级结构预测、三级结构预测、蛋白磷酸化位点、亚细胞定位及功能预测、同源性及系统发育等进行系统分析，弄清楚GnIH的基因及蛋白的理化性质，构型、构像及在细胞内的结合位点，有利于为后续繁殖功能研究提供理论依据。同时，本项目以睾丸间质细胞和卵巢颗粒细胞为模型，分别从雄性和雌性方面对RFRP-3/GnIH 的作用进行了分析。一方面，构建GnIH过表达慢病毒载体转染小鼠睾丸间质细胞(TM3)，通过检测GnIH在TM3细胞中的过表达、睾酮分泌、TM3细胞增殖与凋亡，睾酮合成及凋亡相关基因表达。另一方面，从干扰和过表达二个层面构建慢病毒介导的GnIH载体，感染原代小鼠卵巢颗粒细胞，检测慢病毒感染后对细胞GnIH表达、颗粒细胞增殖、凋亡和雌激素分泌等开展一系列研究，从雄性和雌性全方位揭示GnIH对生殖细胞的调控作用。在RFRP-3对卵泡发育作用机制研究上，本项目分析了RFRP-3对哺乳动物原始卵泡发育和有腔卵泡发育的作用及其机理。在原始卵泡研究方面，主要是RFRP-3及其受体在原始卵泡定位及表达变化、RFRP-3对原始卵泡发育为生长卵泡的影响等方面阐明了RFRP-3对原始卵泡发育的作用机理；在有腔卵泡研究方面，基于RFRP-3/GnIH与抑制素的作用相同且缺少RFRP-3的抗体，因此，结合我们多年的研究基础，本项目利用具有相同功能的抑制素进行有关机理研究，一是从免疫佐剂CpG-OD通过死亡受体通路信号通路对抑制素拮抗小鼠卵巢颗粒细胞发育和激素分泌的调控，二是分析Wnt-Catenin信号通路在卵母细胞成熟过程中的调控作用，通过信号通路分析其如何介导卵母细胞成熟过程。总之，通过本项目一系列研究，从卵泡发育过程入手研究揭示RFRP-3对哺乳动物卵泡发育的作用机理。

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