人肝微粒体CYP代谢药物个体差异技术平台的建立及关键基础研究

Human liver microsomes (HLM) have been used to study drug metabolism as a conventional method, but the influence of genetic polymorphism and variation of CYP content are unclear owing to the lack of the biological data of HLM. We have already built up of a bank including 150 normal human livers. Biological range and individual variation of content,such as total and subtypes of CYP, and HLM protein, can be determined in 150 normal human liver tissues . The enzyme kinetics of 10 kinds of CYP subtype is used to identify the individual variation of drug metabolism by CYP in HLM. To further explore the mechanism of individual variation, the effects of genetic polymorphisms, content of total and subtypes of CYP, HLM protein on the individual variation of drug metabolism would been assessed. Above all, the main influencing factors of drug metabolism could be explored. We can find the obvious different variation of human liver tissues, and build up a platform used to study the individual variation of drug metabolism in HLM.

尽管采用人肝微粒体研究药物代谢已成为常规方法，但CYP的基因多态性和含量的差异性对药物代谢的影响尚不明确，其中CYP及其亚型、微粒体蛋白等的生理含量缺乏是重要原因之一。 以已收集的150例正常人肝微粒体10种CYP亚型为研究对象，探讨药物代谢个体差异的关键基础。先对正常人肝微粒体中影响药物代谢的因素（CYPs及其亚型、微粒体蛋白）进行定量，明确正常生理范围，发现个体差异程度；选用特异性探针，研究10种CYP亚型的酶动力学，发现药物代谢的个体差异程度。进一步探讨个体差异的原因，对10种CYP亚型进行基因分型，明确基因多态性对药物代谢的影响，发现基因型对个体差异的影响程度；研究10种CYP亚型含量、CYP总量和微粒体蛋白含量等对药物代谢的影响，发现上述生理含量对个体差异的影响程度。综上研究，以求阐明影响药物代谢的主要因素及其影响程度，建立采用人肝微粒体研究药物代谢个体差异的技术平台。

CYP代谢药物呈现较大的个体差异，CYP基因多态性、CYP及其亚型、微粒体蛋白等的生理含量差异性可能是重要原因之一。对已收集的105例正常人肝标本为研究对象，测定CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4/5等10种亚型的代谢活性，结果显示CYP活性存在较大个体差异，CYP2C19个体差异最大，达600倍之上。对中国人群中发生频率大于1%的CYP多态性位点的测序发现，只有包括CYP2A6、2B6、2C9、2D6和3A4/5在内的26个多态性位点对活性存在一定的影响，具体表现在CYP2A6*4、CYP2A6*9、CYP2B6 516G>T、CYP2B6 785A>G、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2D6 100C>T与显著降低的CYP活性有关。.采用CO差示光谱法对CYP总量测定的结果显示CYP总量为50.24～814.93 pmol/mg，差异达16倍，且CYP总量的差异是引起酶代谢活性个体差异的重要因素。以CYPOR回收率为标准，对微粒体蛋白含量的绝对定量显示范围为6.71～127.95mg/g肝组织，个体差异达19.07倍，且每克肝组织中微粒体蛋白含量(MPPGL)的差异是引起CYP代谢活性个体差异的重要因素。采用稳定同位素稀释内标-多反应监测–质谱技术（SID-MRM-MS）法对正常人肝10种CYP亚型的绝对定量显示含量个体差异倍数最大的为CYP3A4和3A5，分别达129.0和99.9倍，差异最小的CYP2C9和2C8分别为10.8和11.6倍。10种CYP中，CYP2E1和2C9的含量最高，分别占10种酶总量的24.8%和23.9%；CYP3A4、1A2和3A5的含量接近，分别占12.0%、10.3%和10.3%；CYP2C8、2D6和2A6含量较低，占6.8%、5.0%和3.8%；含量最低的是CYP2C19和2B6，分别占2.1%和1.1%。只有包括CYP1A2、2A6、2E1和3A5在内的4种CYP亚型含量和Vmax存在中等或弱相关性。.综上研究，通过对10 种 CYP 亚型含量、 CYP 总量和微粒体蛋白含量对药物代谢影响的研究，显示上述生理含量可显著影响药物代谢，且生理含量差异性是药物代谢个体差异的重要因素，最终建立采用人肝微粒体研究药物代谢个体差异的技术平台。

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