NOX1介导的活性氧调控Rac1/Cdc42-ERK1/2通路在血小板前体微管重排中的作用及机制研究

The cytoskeleton rearrangement of megakaryocyte for proplatelet(PPF) is the key step of platelet production, while Rac1/Cdc42 mediates tubulin cytoskeleton reorganization of PPF. As known, PPF formation is orchestrated by reactive oxygen species(ROS), however, the regulation mechanism has not been fully uncovered. Our early study showed that ROS accumulation caused by NOX1 over-expression could not only stimulate Rac1/Cdc42 activity and then result in ERK1/2 phosphorylation, but also lead to the reorganization tubulin cytoskeleton to one cell polar, which indiates that ROS may regulate the reorganization of tubulin cytoskeleton via Rho GTPase activation. Therefore, we postulate that ROS from NOX1 is likely to promote tubulin cytoskeleton reorganization to facilitate PPF formation through the regulation of Rac1/Cdc42-ERK1/2 signaling. In this study, by using RNA interference and laser confocal, etc, we intend to investigate the molecular mechanism of Rac1/Cdc42 activity and subsequent tubulin cytoskeleton reorganization regulated by ROS from NOX1, which aims to explore the exact role of ROS on PPF formation, and then to provide new insights into the study of terminal stages of thrombopoiesis.

巨核细胞经细胞骨架重排形成血小板前体(PPF)是血小板生成的关键环节，Rac1/Cdc42介导了PPF微管tubulin的重排。活性氧(ROS)在促进PPF形成过程中发挥着枢纽作用，但具体调控机制不明。我们研究发现，NOX1过表达后ROS生成增加不仅可引起Rac1/Cdc42活性增强而激活ERK1/2通路，而且会促进微管向细胞一极聚集，提示ROS具有激活Rho GTP酶而调控微管重排的作用。因此，我们推测NOX1介导的ROS可能通过调控Rac1/Cdc42-ERK1/2通路而促进微管重排，从而促进PPF形成。本项目拟以人CD34+细胞诱导分化形成的巨核细胞和巨核细胞株Meg-01为研究对象，采用RNA干扰和激光共聚焦等分析技术，分析NOX1介导的ROS调控Rac1/Cdc42活性及其引起微管重排的分子机制，探讨ROS在PPF形成中的具体作用，从而为血小板生成终末阶段的调控研究提供新思路。

围绕血小板生成，尤其是血小板生成中晚期阶段的调控机制，我们分析了NOX1调控的活性氧（ROS）和神经内分泌在血小板生成终末分化阶段的影响，主要取得的进展如下：.1. 通过构建NOX1的过表达或RNA干扰载体，利用Western Blot技术和免疫共沉淀等分析方法，发现NOX1介导的ROS是巨核细胞终末分化的重要调控因素；进一步分析发现，NOX1通过影响Rac1/Cdc42活性而影响下游信号分子cofolin、ERK1/2 以及IQGAP1的磷酸化或表达水平，从而调控巨核细胞内tubulin细胞骨架重排，影响血小板前体形成；.2. 发现巨核细胞内Rac1还可反馈调控NOX1表达，影响巨核细胞内ROS水平，从而对血小板前体形成发挥反馈调控作用；.3. 在揭示ROS在血小板生成过程中发挥重要调控作用的基础上，利用流式细胞仪、Western Blot、PCR和Transwell等分析方法，发现神经递质多巴胺可通过促进细胞内ROS生成而促进巨核细胞生成血小板。进一步分析发现，交感神经递质(肾上腺素EPI和去甲肾上腺素NE)通过激活α2受体/ERK1/2信号通路而促进巨核细胞的粘附及其向血管“龛”的迁移，从而加速其分化成熟和产板。体内实验证实，注射NE和EPI可促进放射损伤小鼠血小板恢复。本研究不仅揭示了放射损伤血小板水平持续低下的原因，也为放射损伤血小板减少症的综合救治提供了新的思路。此外，还发现多巴胺（DA）能够通过促进巨核细胞内ROS生成而促进巨核细胞释放血小板。.4. 利用已充分建立的血小板生成分析研究平台，发现IGF-1能够通过激活ERK1/2和AKT信号通路，促进巨核细胞β1-tubulin细胞骨架重排，加速血小板前体形成和巨核细胞产板。深入研究表明，与血小板生成素（TPO）主要通过激活ERK1/2通路而在血小板生成早期阶段发挥调控作用不同，IGF-1的促血小板生成作用并依赖于经典的TPO通路，但需要类固醇辅活化子-3(SRC-3)的协助。本研究为人们深入认识内分泌轴在血小板生成中的独特调控作用提供了新的研究思路。

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