甲烷古菌核糖体RNA加工成熟机制

Ribosomal RNA genes usually constitute as a polycistronic operon and transcribe as a precursor RNA (pre-rRNA), followed by processing to generate mature rRNAs before ribosome biogenesis. However, processes of archaeal pre-rRNA processing and maturation are poorly understood. In previous study of genome-wide RNA processing sites identification of Methanolobus psychrophilus, we found that rRNAs harbor several processing sites. Because archaeal 16S and 23S rRNA processing involves the cleavage of the BHB motif, so it is speculated that the circularization of the rRNA molecules will occur. The formation of circular processing intermediates is a unique phenomenon of archaeal pre-rRNA maturation which is distinct from that of bacteria and eukaryotes. In this project, Methanolobus psychrophilus and Methanococcus maripaludis are selected as research objects to study the processing and maturation of their pre-rRNA. The research content includes: 1) confirm the cleavage of pre-rRNA BHB motif and find the corresponding ribonuclease; 2) verify the presence of circular processing intermediates; 3) identify the endoribonuclease responsible for linearization of circular intermediates. The aim of this study is to reveal the molecular mechanism of processing and maturation of methanogenic pre-rRNA which will fill the gap in the field of archaeal pre-rRNA processing and shed light on the rRNA maturation and evolution of the three domains of life.

核糖体RNA基因通常共转录为多顺反子前体rRNA (pre-rRNA)，须经加工生成成熟的rRNAs方能参与核糖体组装。但目前对古菌pre-rRNA加工成熟过程知之甚少。我们前期在对嗜冷甲烷叶菌组学水平的RNA加工位点测序中捕获到其rRNAs的加工位点，且16S和23S rRNA加工中间体具有BHB motif，推测它们可能会产生环化中间体，这可能是古菌pre-rRNA成熟过程有别于细菌和真核生物的独特步骤。本项目拟选择嗜冷甲烷叶菌和海沼甲烷球菌研究古菌pre-rRNA的加工成熟过程。内容包括：1) 证明pre-rRNA BHB motif切割的存在并发现切割的功能酶；2) 证明环化中间体的存在；3) 探索环化中间体开环的核酸内切酶。研究旨在揭示甲烷古菌pre-rRNA加工成熟的分子机制，填补古菌pre-rRNA加工成熟研究的空白，为认知三域生命rRNA加工成熟策略异同及进化演变提供思路。

核糖体RNA基因通常组成操纵子形式并共转录成前体核糖体RNA，因此，前体核糖体RNA的加工成熟对核糖体生成至关重要。目前对古菌尤其是甲烷古菌核糖体RNA加工成熟还知之甚少。本研究我们以嗜冷甲烷叶菌和海沼甲烷球菌为研究对象研究其核糖体RNA成熟机制。两株甲烷古菌16S、23S rRNA两翼序列互补配对形成茎环结构，该结构包埋了一个凸起-螺旋-凸起 (bulge-helix-bulge, BHB) 基序。酶学实验证明核酸内切酶EndA负责BHB motif的加工。RT-PCR和Northern blot证实了EndA加工之后16S、23S rRNA形成了环状中间体。在嗜冷甲烷叶菌中，核酸内切酶Nob1在16S环状中间体的3′末端内切，线性化环状中间体并产生3′成熟末端进而暴露SD序列，而在海沼甲烷球菌中，未知核酸内切酶EndoU在16S环状中间体的5′末端内切，线性化环状中间体并产生5′成熟末端。16S rRNA环状中间体开环后产生的5′延伸或3′延伸分别通过5′-3′外切或内切作用去除。环化RT-PCR和5′-RACE则检测到23S rRNA具有2个5′成熟末端，该末端恰好与23S rRNA的3′成熟末端形成配对结构，提示两株甲烷古菌23S rRNA环状中间体的开环需要一个RNA结构依赖的核酸内切酶。对于5S rRNA，两株甲烷古菌5S rRNA 5′成熟末端上游均发现了序列特异性加工位点，说明它们采用了内切外切相协同的机制。通过序列比对，发现该机制普遍存在于甲烷古菌5S rRNA加工成熟过程中。通过对古菌rRNA加工过程中环化、线性化相关位点和蛋白的保守性分析，发现BHB motif、核酸内切酶EndA等均是保守存在的，说明形成环状中间体是古菌域广泛使用的rRNA加工成熟机制。与此同时，两株甲烷古菌16S rRNA环状中间体开环位点和所需核酸内切酶的不同也提示不同的古菌进化出了多样性的rRNA加工成熟策略。

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