人类病原真菌新型隐球菌中组蛋白变体H3.3调控RNA可变剪切的分子机制研究

H3.3 is the transcriptional activation-associated histone H3 variant, who plays a key role in regulating multiple key physiological and developmental events. However, it’s biological function, especially in regulating gene expression, remains largely unknown. We previously discovered that knocking out the gene encoding H3.3 in the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans has no effect on gene mRNA levels, but unexpectedly results in different types of RNA alternative splicing in hundreds of genes, some of them are related to virulence, supporting our hypothesis that histone variant H3.3 may play a key role in regulating RNA alternative splicing. Here, in order to explore the epigenetic regulation of gene expression and fungal virulence by H3.3, we seek to propose this research with two specific aims: (1) Unravel the action modes of H3.3 coordinates histone replacement, modification of histone methylation, specific histone variant enrichment, as well as deposition of RNA spliceosome in the genomic regions of gene targets, identify molecular mechanisms of how this interaction regulates alternative splicing and therefore affects gene expression; (2) Illustrate molecular bases of H3.3 participates in regulating fungal pathogenicity. This study is expected to unravel epigenetic mechanisms of how H3.3 influences gene expression and fungal pathogenicity by regulating RNA alternative splicing . Moreover, we hope that our proposed research can provide important insights on identifying new targets of anti-fungal drugs based on epigenetic regulation.

H3.3是与转录激活有关的组蛋白H3变体，对生物很多生理发育过程具有重要作用，但其调控基因表达的分子机制尚未完全阐明。申请人前期工作首次发现人类病原真菌新型隐球菌中敲除组蛋白变体H3.3不影响基因mRNA转录水平，却导致包括毒力基因在内的上百个基因发生各种形式的RNA可变剪切，说明H3.3在RNA可变剪切调控的重要作用。为探索H3.3调控RNA可变剪切和真菌毒力的分子机制，本项目拟开展如下研究：1）揭示目标基因区域H3.3协调组蛋白替换、组蛋白甲基化修饰、分子伴侣招募和RNA剪接复合体定位的作用方式，发现这种相互作用机理共同调控RNA可变剪切影响基因表达的分子机制；2）阐明H3.3参与调控真菌毒力的分子证据。本研究预期将揭示H3.3调控RNA可变剪切影响基因表达和真菌毒力的表观遗传调控新机制，为发现可能的抗真菌药物新作用靶点、开发研制基于表观遗传调控的抗真菌感染新药提供实验依据和研究思路。

核小体调控细胞生物过程的一个重要方式是通过组蛋白变体替换，其中组蛋白H3变体H3.3与转录激活密切有关。尽管与常规组蛋白H3仅有几个氨基酸的区别，但却能由特异的分子伴侣介导，整合进入染色质的特定区域，对生物很多生理发育过程发挥重要作用。然而，H3.3与H3之间通过什么机制进行替换，H3.3与组蛋白修饰存在什么相互关系，以及H3.3在染色体高级结构基础上的基因表达调控具体机制等，这方面的研究还十分有限，许多具体的分子机制尚不清楚，还有待深入研究。本课题围绕这些科学问题，以单倍体酵母类病原真菌新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)为对象，重点研究该真菌组蛋白变体H3.3的基因表达调控功能，阐明H3.3通过调控RNA可变剪切影响基因表达的分子机制以及揭示该组蛋白变体调控新型隐球菌致病性的可能机制。我们的研究取得了一系列重要成果，关键的研究发现包括：1）新型隐球菌H3.3蛋白复合体高度保守，H3.3在全基因组的分布与其转录激活功能正相关；2）RNAseq分析结果发现敲除H3.3导致153个基因表达特异性发生变化，然而令人意外的是，仅仅只有17个基因转录被抑制，反而136个基因的表达特异性上调。推测可能因为H3.3敲除并不影响这些基因正常转录的mRNA，而有可能是因为H3.3缺失导致这些基因区域无法招募H3替代而成为裸露DNA，进而由于转录异常起始导致大量异常转录本产生；3）基于PacBio平台的全长转录组测序结果分析表明，敲除H3.3导致在染色体端粒和着丝粒这些转录沉默区域出现异常活跃转录，说明H3.3可能在维持染色体异染色质结构方面起重要作用；3）利用染色质开放性测序技术（ATAC-seq）探讨H3.3缺失对新型隐球菌全基因组染色质结构影响特征，结果发现：H3.3敲除表达显著上调的基因以及出现不同大小转录本的端粒和着丝粒都存在升高的染色质可及性的区域，正相关性非常明显，充分说明这些区域的转录与H3.3的调控直接相关。综合以上结果，我们的结果首次发现H3.3的全新生物学功能：组蛋白变体H3.3在维持新型隐球菌基因组稳定性，防止基因异常转录方面发挥非常重要的调控作用。在深入开展本课题研究内容的同时，我们还进行了另一个课题的研究：不同宿主背景影响新型隐球菌基因型和毒力表型的相关性分析。该研究揭示了环境条件与新型隐球菌基因型、毒力表型和临床表现存在正相关性。

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