miR-34a/MDM4/p53反馈通路在慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡中的作用机制研究

Chronic lymphocytic leukemia(CLL) remains incurable disease,despite of the recent progress in clinical and translational field. Multiple mechanisms are involved in apoptosis-resistant of chronic lymphocytic leukemia cells, among which MDM4 is a novel regulatory factor in p53 signaling pathway. MDM4 plays a crucial role in regulating p53 activity and involved in apoptosis of CLL, it can inhibit p53 function and its downstream molecular-miRNA-34a by binding to p53 functional domain. Recent studies suggest that miRNA-34a may act as a tumor suppressor by regulating apoptosis in several malignant cell lines. However, the accurate mechanism by which miRNA-34a regulates tumour cells apoptosis is unclear..Our preliminary experiment displayed that transfection of miRNA-34 mimics will induce apoptosis of primary CLL cells in vitro in p53-dependent manner, which indicated that there is potential feedback regulation involving classic MDM4-p53-MiR-34a pathway regulating apoptosis of CLL. The purpose of our study is to verify the hypothesis: ①To determine miRNA-34a expression in large-scale samples of CLL patients and its methylation regulation; ② To comfirm the interaction between MDM4 and p53 by using co-immunoprecipitation, and explore expression and exact function of MDM4 in primary CLL leukemia cells; ③ To predict direct interaction between miR-34a and MDM4 through bioinformatics database, and further verify it by employing dual-luciferase reporter assay system; ④To investigate potential targeted therapy basing on miR-34a/MDM4/p53 feedback signaling pathway. .We expect to comfirm and elucidate exact role of miR-34a/MDM4/p53 feedback circuitry in apoptosis of CLL,which will provide a novel direction of CLL diagnosis and treatment paradigm.

慢性淋巴细胞白血病(CLL)存在多种因素导致的细胞凋亡受抑，其中MDM4是新发现的p53调控因子之一，可以通过结合p53抑制其功能及下游的miRNA-34a表达，参与CLL的凋亡过程。但我们预试验发现转染miR-34a模拟体可以使CLL细胞凋亡增加，并呈p53依赖性，提示经典的MDM4-p53-MiR-34a通路可能存在反馈机制调节CLL细胞凋亡。本研究拟针对此假说开展以下研究：①研究CLL中miR-34a异常表达及是否存在甲基化对此的调控；②免疫共沉淀法验证MDM4/p53相互作用，检测CLL患者MDM4表达并进行功能研究；③应用生物信息学方法预测miR-34a/MDM4相互作用并采用双荧光素酶报告系统确认；④体外细胞水平开展针对miR-34a/MDM4/p53通路的分子靶向治疗。通过研究阐明miR-34a/MDM4/p53反馈通路在CLL凋亡中的机理并为临床诊治提供思路。

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方成人白血病中发病率最高的类型，我国以往认为此类疾病发病率较低，但是随着生活方式的改变和人口老龄化使得我国CLL的发病率有逐年增加的趋势，日益成为危害我国国民健康的重要疾病之一。慢性淋巴细胞白血病(CLL)存在多种因素导致的细胞凋亡受抑，其中MDM4是新发现的p53调控因子之一，可以通过结合p53抑制其功能及下游的miRNA-34a表达，参与CLL的凋亡过程。但我们预试验发现转染miR-34a模拟体可以使CLL细胞凋亡增加，并呈p53依赖性，提示经典的MDM4-p53-MiR-34a通路可能存在反馈机制调节CLL细胞凋亡。通过本项目研究我们得到以下结论：①通过分析MDM4及其同型异构体截短（S-MDM4）在CLL中的表达和临床指标的相关性，使用定量PCR技术检测发现CLL患者存在MDM4及S-MDM4的异常表达，并且发现MDM4和S-MDM4表达异常和CLL的预后生存相关。②利用体外原代CLL细胞模型以及miRNA转染技术发现miR-34a对CLL细胞凋亡影响，以及miRNA-34a对MDM4的调控作用，进一步采用双荧光素酶报告系统确认miR-34a对于MDM4的直接调控作用。③在以上研究的基础上，通过体外原代CLL细胞证实了在CLL细胞中存在miR-34a/ MDM4/p53反馈通路的调节机制，以及和CLL细胞凋亡的相关性。. 本研究着眼于重要的凋亡分子p53及其调控因子MDM4和miR-34a，通过研究能够更为深入了解CLL的凋亡机制，为CLL患者的预后和分层治疗提供新的理论基础，从而提高CLL临床治疗的疗效、提高患者生存；而通过本研究建立的包括p53、miR-34a和MDM4等分子的检测方法，由于非常实用的临床价值。本研究项目发现并证实的反馈调节通路不仅进一步阐述CLL凋亡的分子机制，而且为潜在靶向治疗提供理论依据。. 通过本项目研究获得成果如下：①通过本研究共发表论文11篇（均标注本研究项目名称和编号），其中SCI收录论文9篇，中文核心期刊2篇。②通过本研究共培养研究生3名，其中博士研究生1名，硕士研究生2名。③通过本项目研究成果申报江苏省新技术引进奖，并获得2013年江苏省新技术引进奖二等奖一项。

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