苦瓜核糖体失活蛋白-单聚乙二醇结合物的结构特性与功能研究

Site-directed polyethylene glycol (PEG) modification techniques for proteins or peptides have become a research focus in the PEG modification of protein and polypeptide drugs. Our preliminary study found that two ribosome-inactivating proteins, α-MMC and MAP30, from bitter melon seeds can obtain mono-PEGylated counterparts after chemical modification with 20kDa mPEG-ALD. Their immunogenicity decreased significantly in vitro and can retain a high biological activity as well as obvious optimization of properties. However, the relationship between structure and anti-tumor activity in vivo are not clear now. According to the above results, this project intends to utilize MALDI-TOF-MS, Edman and other protein structure strategy to analyze properties and structure of mono-PEGylated-α-MMC/MAP30. Through replication in vivo animal experimental model, applying molecular biology, FCM and other techniques can determine their in vivo anti-tumor effect, pharmacokinetic characteristics and toxic effects. Additionally, we can also provide an enzyme-coupled method for detecting ribosome-inactivating proteins activity. The results from this project can offer new theoretical and experiment basis.

蛋白质或多肽的定点聚乙二醇化学修饰技术已成为PEG修饰蛋白质、多肽类药物的研究热点。我们的预研结果发现α-MMC和MAP30两种核糖体失活蛋白经20KDa mPEG-ALD修饰后获得单PEG结合物，与原药比较，它们在体外的抗原性明显降低、保持较高生物活性以及物化特性明显优化，但其结构与体内抗肿瘤效果等生物功能关系尚不清楚。本项目基于上述研究，拟运用MALDI-TOF-MS、Edman与其它蛋白质结构分析手段相关联，对α-MMC和MAP30单PEG结合物的特性和结构进行解析；通过复制动物体内实验模型，采用分子生物学、流式细胞等技术从整体、组织器官、细胞和蛋白质层次明确其抗肿瘤的作用效果、药代动力学优化和毒副作用的降低或消除程度、量效和时效关系；同时也可提供一种偶联酶法测定RIP活性的新方法。上述研究成果可为α-MMC和MAP30的药用价值提供新的理论依据和实验基础。

项目通过蛋白质定点聚乙二醇（PEG）化学修饰技术将α-MMC和MAP30两种核糖体失活蛋白经20KDa mPEG-ALD和mPEG-SC修饰，通过离子交换层析、分子筛层析优化组合，最终可获得纯度96%以上的两种单PEG结合物，高效纯化方法的建立为后期研究提供了充足的样品保证。经过对单PEG修饰物基本性质鉴定后（包括电泳、残留PEG检测、等电点、分子量等），我们针对核糖体失活蛋白活性测定建立了3套体外快速测定的方法，其中，利用核糖体失活蛋白能高效催化rRNA的类似物NAD+中N-糖苷键断裂而释放出产物腺嘌呤的特点，设计了一项可体外快速测定核糖体失活蛋白活性的方法，这为本项目样品纯化制备和后期体内外抗肿瘤活性检测都提供了良好的技术方法保障，并以第一发明人获得国家发明专利一项（专利号：ZL 2016 1 0451601.3），另外两种不同思路的活性测定方法也已经申请专利。与原药进行比较，揭示它们在体外均保持了较好的抗肿瘤效果，且保持有较高生物活性以及物化特性明显优化。在此基础上，利用MALDI-TOF-MS、Edman与其它蛋白质结构分析手段相关联，对α-MMC和MAP30单PEG结合物的结构进行了必要的解析，揭示该两种核糖体失活蛋白均结合一分子的PEG且结合位置在N-末端，同时PEG的结合并未改变原来蛋白质的二级结构。同时我们还建立了裸鼠人源异种移植瘤模型，考察了RIP及其单PEG结合物的体内抗肿瘤效果，结果证实修饰后的RIP仍能保留大约60%的抗肿瘤活性，而毒性有一定程度的降低。通过液质联用技术（LC-MS/MS）测定了大鼠血液中原形药物浓度，获得了t1/2、AUC、V、CL等动力学参数，并比较了α-MMC和MAP30经单PEG修饰前后的药时曲线和药代动力学参数，结果表明经单PEG修饰后的RIP半衰期明显延长。通过免疫双扩散和ELISA检测小鼠血清中的抗体滴度，证明α-MMC和MAP30两种核糖体失活蛋白经20KDa mPEG-ALD和mPEG-SC修饰后获得的单PEG结合物在结构上可以改善原药的天然弱点，可在一定程度上降低毒性反应和免疫原性。这些研究成果可为α-MMC和MAP30的药用价值提供新的理论依据和实验基础。

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