CRISPR/CAS9诱导猪基因组损伤修复机制研究及其在精准基因编辑中的应用

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31871292
  • 项目类别：
    面上项目
  • 资助金额：
    59.0万
  • 负责人：
    黄黎珍
  • 依托单位：
    华南理工大学
  • 学科分类：
    C0601.遗传物质结构与功能
  • 结题年份：
    2022
  • 批准年份：
    2018
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2019-01-01 至2022-12-31

项目摘要

With the introduction of genome editing using CRISPR/CAS9 technology, the efficiency of porcine genome editing has been increased dramatically owing to inducing DNA double strand breaks (DSBs) and stimulating repair pathway. However, the efficiency of precise genome editing ( such as knockin, point mutation) was relative low because the DSBs were repaired mainly by error-prone nonhomologous end joining pathway, but not the precise repair pathway-homologous recombination(HR). Many research indicated that the efficiency of precision genome editing could be improved by modulating DNA repair pathways and increasing HR activity. And the DNA repair mehanism differed among different species. Therefore here we intend to study the specific DSBs repair mechanism of pig and find out the key and high efficient factors that control the repair pathway, then improve the porcine precise genome editing with those key targets or factors. The research will help to improve porcine precise genome editing greatly.
CRISPR/CAS9技术通过靶向诱导基因组断裂损伤，启动自身损伤修复通路，使基因编辑猪的效率大幅提高。然而由于介导精准编辑的同源重组修复发生概率远远低于随机剪切插入的非同源末端连接修复，导致CRISPR/CAS9介导基因定点插入、突变等精准编辑的效率仍然较低。大量研究表明，通过调控宿主细胞基因组损伤修复通路，增强其同源重组修复水平，可有效提高精准基因编辑的效率；且不同的物种间DNA损伤修复机制存在一定差异。因此本研究拟应用单细胞和转录组测序技术，揭示猪体细胞及胚胎在Cas9损伤后的特异性修复机制，筛选其高效特异性通路调控元件；并以特异性关键元件为靶点调控修复通路，增强同源重组修复，从而提高猪体细胞及胚胎细胞的精准编辑效率，为精准基因编辑猪的高效制备奠定基础。

结项摘要

CRISPR/Cas9基因编辑猪作为疾病模型或器官移植供体在生物医药中具有重要意义。Cas9基因编辑包含DNA靶向剪切及修复两个过程，不同修复通路产生插入、删除及突变等不同编辑结局，修复是决定编辑结局的关键核心。因此，探究Cas9靶向剪切后的修复通路是实现精准编辑的重要环节之一。本项目应用高通量CRISPR基因编辑技术，在全基因组水平探究猪细胞内Cas9剪切修复通路及关键调控元件，为实现更精准基因编辑奠定基础。首先项目针对猪全基因组设计约11万条sgRNA，通过病毒感染及筛选成功构建高质量猪胚胎成纤维细胞CRISPR基因敲除文库。同时系统评估常用无启动子荧光报告系统在精准编辑评估中的准确性，并进一步设计建立Repair-Seq与高通量文库筛选结合的高精准Cas9编辑报告系统。基于高通量细胞文库及新型报告系统，项目发现猪胚胎成纤维细胞内靶点修复结局呈现系列规律，其中插入编辑中，插入位点主要分布在PAM上游3-4bp或2-3bp，插入大小主要为1bp。短片段删除则均匀分布切割位点两侧，短微同源删除及突变占比较少。编辑结局差异基因及通路富集结果发现，MRE11可显著抑制1bp插入，而ZNF281、PRKACB等显著促进1bp插入。同时结合293T细胞文库的数据发现大量NHEJ促进1bp等短片段插入，而HR及micro HR显著抑制插入。此外，Small Deletion中富集Base excision Repair，而在Large Insertion中富集p53 signaling pathway。同时，GYPC、KIAA1456、PPIAL4E、hsa-mir-4769和TNFRSF10C等显著促进突变产生。以上结果将为进一步提高猪Cas9精准编辑效率提供重要前期研究基础，项目中所建立系列文库及相应大数据分析平台亦将为基因编辑机制研究提供关键的技术及平台支持。

项目成果

期刊论文数量（5）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（2）
Roles of diclofenac and its metabolites in immune activation associated with acute hepatotoxicity in TgCYP3A4/hPXR-humanized mice
双氯芬酸及其代谢物在 TgCYP3A4/hPXR 人源化小鼠急性肝毒性相关免疫激活中的作用
  • DOI：
    10.1016/j.intimp.2020.106723
  • 发表时间：
    2020-09-01
  • 期刊：
    INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY
  • 影响因子：
    5.6
  • 作者：
    Jiang, Weifan;Dai, Tianming;Dai, Renke
  • 通讯作者：
    Dai, Renke
Knockout of ABC transporters by CRISPR/Cas9 contributes to reliable and accurate transporter substrate identification for drug discovery.
通过 CRISPR/Cas9 敲除 ABC 转运蛋白有助于药物发现中可靠、准确的转运蛋白底物识别
  • DOI：
    10.3389/fphar.2022.1015940
  • 发表时间：
    2022
  • 期刊：
    Frontiers in pharmacology
  • 影响因子：
    5.6
  • 作者：
  • 通讯作者：
Efficient base editing for multiple genes and loci in pigs using base editors
使用碱基编辑器对猪的多个基因和基因座进行高效碱基编辑
  • DOI：
    10.1038/s41467-019-10421-8
  • 发表时间：
    2019-06-28
  • 期刊：
    NATURE COMMUNICATIONS
  • 影响因子：
    16.6
  • 作者：
    Xie, Jingke;Ge, Weikai;Lai, Liangxue
  • 通讯作者：
    Lai, Liangxue
Validation Study to Determine the Accuracy of Widespread Promoterless EGFP Reporter at Assessing CRISPR/Cas9-Mediated Homology Directed Repair.
确定广泛使用的无启动子 EGFP 报告基因在评估 CRISPR/Cas9 介导的同源定向修复方面的准确性的验证研究
  • DOI：
    10.3390/cimb44040116
  • 发表时间：
    2022-04-12
  • 期刊：
    CURRENT ISSUES IN MOLECULAR BIOLOGY
  • 影响因子：
    3.1
  • 作者：
    Xu, Wanqing;Zuo, Qingxia;Feng, Dongyan;He, Changsheng;Lin, Cailing;Huang, Dongchao;Wan, Yanbin;Chen, Feng;Mo, Guosheng;Sun, Qi;Du, Hongli;Huang, Lizhen
  • 通讯作者：
    Huang, Lizhen
Efficient generation of a CYP3A4-T2A-luciferase knock-in HepaRG subclone and its optimized differentiation
CYP3A4-T2A-荧光素酶敲入HepaRG亚克隆的高效生成及其优化分化
  • DOI：
    10.1016/j.biopha.2022.113243
  • 发表时间：
    2022-06-07
  • 期刊：
    BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY
  • 影响因子：
    7.5
  • 作者：
    Zuo，Qingxia;Xu，Wanqing;Huang，Lizhen
  • 通讯作者：
    Huang，Lizhen

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  • 影响因子：
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  • 作者：
    黄黎珍
  • 通讯作者：
    黄黎珍

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

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          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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