纤维素酶BsCel5B高效降解半纤维机制及分子改良研究

The degradation of non-starch polysaccharides in animal feed requires the cooperation of cellulases and hemicellulases. A cellulase with great hemicellulase activity is favorable for the potential application in the feed industry. However, all reported cellulases have low hemicellulase activity, which is far from the industrial requirement. In our previous study, a highly-active, multi-functional GH5 cellulase BsCel5B was obtained, which had great specific activities towards CMC (960 U/mg), barley -glucan (2774 U/mg) and mannan (3794 U/mg) but not xylan (the main component of hemicellulose). The present study aims to modify BsCel5B for higher cellulase, mannanase and xylanase activities. Evolutionary analysis of GH5 members will be conducted to identify the key residues and regions of BsCel5B related to substrate recognization, binding and catalysis. By employing directed evolution and site-directed mutagenesis, the hemicellulose-degrading mechanism will be revealed. Moreover, through rational design and structure alignment, BsCel5B mutants with different substrate-degrading capacities will be constructed. The catalytic channel will be modified by mutagenesis, which will endow BsCel5B or other GH5 enzymes the capability to control substrate selection between specificity and heterozygosity (multi-function). As results, a multi-functional enzyme with great cellulase, mannanase and xylanase activities will be created. This study is of scientific and commercial importance to provide theoretical basis for the molecular modification of GH5 cellulases for substrate selection.

饲料中非淀粉多糖降解需要纤维素酶和半纤维素酶共同作用。多功能纤维素酶的发现使单酶降解多种多糖成为可能。目前报道的纤维素酶的半纤维素酶活力都很低，不能满足应用的需要。我们获得了一个性质优良的高比活纤维素酶BsCel5B，同时具有很高的半纤维素酶活力，降解葡聚糖、甘露聚糖的比活分别为2774和3794U/mg。本项目拟在GH5家族酶进化分析基础上，以BsCel5B为核心材料，采用定向进化方法驯化其功能，获得具有单、双及三功能的酶，找到BsCel5B功能分化的节点。在解析BsCel5B与不同底物复合物结构的基础上，确定酶与不同底物的结合模式、催化通道及关键位点，利用突变验证，揭示纤维素酶高效降解半纤维素的机制。进一步利用理性设计实现BsCel5B底物“专一性”与“杂泛性（多功能）”的人工控制，获得超级多功能纤维素酶。指导GH5家族酶底物选择性的分子改良，促进非淀粉多糖酶在饲料中的应用。

糖苷水解酶第5家族真菌纤维素酶 (GH5_5)具有重要的工业应用价值。部分GH5_5纤维素酶具有能够同时水解纤维素和半纤维素底物的双功能特性 (杂泛性)，但其杂泛机制尚不明确。研究GH5_5纤维素酶的杂泛机制，可以指导酶对底物的选择，在简化工艺降低成本方面意义重大。. 利用机器学习法构建隐马尔可夫模型 (HMM)，以性质已知的GH5_5纤维素酶为出发数据集，通过建立与训练模型，对GH5_5家族纤维素酶进行基因挖掘与杂泛性评估，在该家族中挖掘到了高甘露聚糖酶活性的材料。训练后的模型可识别杂泛酶的序列规律，作为判断GH5_5家族纤维素酶杂泛性的有效手段。. 依据杂泛程度的不同分为A (基本不杂泛)、B (杂泛但以纤维素酶活性为主)和C (高度杂泛，以甘露聚糖性质为主)三类。B类是家族主要类型 (约占70%)，A类154条，C类仅有26条序列。纤维素酶BsCel5B甘露聚糖比活力高达1638 ± 33 U/mg，选为本研究的主要材料。. 成功解析 BsCel5B单体、失活突变体BsCel5B-E142Q/E257Q、以及BsCel5B-E142Q/E257Q与纤维四糖和甘露四糖高分辨率晶体结构。BsCel5B为典型的TIM桶状结构，与底物直接结合的氨基酸与其他2类纤维素酶基本一致。. 利用丙氨酸扫描排除了与底物直接相互作用氨基酸对酶杂泛性的影响。随后通过HMM模型搜索，确定了1个与杂泛性质有关的氨基酸位点，即T100 (BsCel5B序列)。 当T100位为疏水性氨基酸V/L/I/M和极性氨基酸S/T/C时，倾向降解甘露聚糖底物；当T100位为酸性氨基酸D/E时，倾向两种底物的平衡。两种活性呈现“负相关” (trade-off)式的平衡关系。.通过与A和B两类纤维素酶的晶体结构进行比较，推测BsCel5B中T100通过影响H102的构象，间接对底物进行选择。D100 (TvCel5A序列)通过与H102形成氢键而阻止了Y104与催化口袋-1位底物的C2-OH的结合；而BsCel5B中，疏水或极性氨基酸通过疏水相互作用，缩短了H102与Y104的距离，稳定的Y104更容易与口袋内-1位底物的C2-OH形成氢键。利用系统发育树探究了GH5_5家族纤维素酶杂泛性存在的进化意义与趋势，验证了T100位点在GH5_5家族的普适性。

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