类风湿性关节炎患者血液及关节液中可溶性钙网蛋白的纯化及免疫生物学活性研究

Calreticulin (CRT) is an important ER luminal resident protein which can regulate Ca2+ homoeostasis and functions as a molecular chaperon helping newly glycoprotein to fold correctly. CRT can anchor on cell membrane of apoptosis cells and certain cancer cells, as an important marker for immune recognition. In recent studies, we have found high concentration soluble CRT (sCRT) in the sera and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis (RA). Prokaryotically expressed recombined CRT exhibited extraordinarily strong immune-stimulatory activities, while native CRT isolated from mouse liver was substantially less active. LPS contamination in our recombinant product was excluded. We propose that unusual biochemical characteristics of sCRT in patient sera (e.g. fragmentation, polymerization and abnormal glycosylation) may be responsible for its potent immunostimulatory effect and render its ability to take part in pathology process leading to RA. In the proposed study, we will affinity purify sCRT from the sera and synovial fluid of 50 RA patients, followed by detailed biochemical and immunological analysis on the products thus obtained. Identification of the minimum biological active fragment of sCRT will also be carried out, and the resultant fragment used for screening of mAbs capable of neutralizing the pro-inflammatory activities of sCRT. This work will help to explain the relationship between serum levels of sCRT and RA and provide new approach for immunotherapy against autoimmune disorders.

钙网蛋白（CRT）广泛表达于内质网，具有维持胞内钙平衡和分子伴侣的功能。CRT亦表达于细胞表面,介导免疫识别、清除异物等生物学功能。我们近期研究发现，类风湿性关节炎（RA）患者血清及关节液中存在高浓度可溶性CRT（sCRT）。原核表达的CRT具有超强免疫刺激活性，而提取自肝脏的天然CRT则大为逊色。经一系列对比研究并排除了重组CRT被LPS污染之后，我们提出假说认为患者体液中的sCRT可能因理化性质的改变（片段化、多聚化、异常糖基化等）而获得免疫刺激和致炎活性，并由此参与RA的病理过程。本研究拟亲和层析纯化50例RA患者血清及关节液中的sCRT，深入分析其理化特性及免疫活性，以探索其作为一种新的致炎因子在RA中的作用机制。还将根据功能分析结果真核表达强活性sCRT片段，进而以其为靶标筛选具有中和作用的单抗。本课题将有助于阐明sCRT与RA密切相关的分子机制，为自身免疫病的治疗提供新思路。

钙网蛋白（CRT）本是内质网上锚定的蛋白，行使分子伴侣以及调节钙稳态的职能。而近年来发现其可异位出现于胞膜以及细胞外基质中，引起了科研工作者的广泛兴趣。本课题组在前期研究中发现在类风湿性关节炎（RA）患者的血清以及关节液中可检测到可溶性的钙网蛋白（sCRT），本项目拟从sCRT在病理状态下的理化性质出发，探讨其对RA病程影响的可能机制。在自然科学基金的资助下，本项目基本完成了预期目标，探讨了sCRT的理化性质及其与免疫刺激活性的关系，并进一步探讨了CRT免疫刺激活性的机制。围绕此课题已发表了3篇SCI论文，另有两篇已整理待发表。. 本课题利用同表位单抗夹心ELISA的方法发现RA患者的血清中存在多聚体形式的CRT，提示多聚化可能是CRT发挥致病作用的机制。并在此基础上发现CRT可在发热、弱酸性环境下发生二聚化乃至多聚化，从而增强其免疫刺激活性。对CRT的分子进一步进行截断突变发现其核心活性片段存在于150-230区域，并且依赖二硫键所介导的多聚化形式。并且利用CHO真核表达系统进一步分析了糖基化对钙网蛋白免疫刺激活性的影响，提示糖基化的改变对其免疫刺激活性也有着非常重要的影响。最后利用小鼠巨噬细胞作为模型探讨了CRT具有免疫刺激活性的机制，通过清道夫受体SRA将CRT内吞入细胞后激活MAPK-NFKB信号通路从而发挥其免疫刺激活性。同时我们考察了CRT对DC细胞的刺激作用，并以CRT为佐剂验证了其通过激活特异性的效应性T细胞的抗肿瘤效应。. 以上结果有助于阐明sCRT与RA的关系，为RA的发病机制以及治疗提供新的靶点。

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