GATA4在人iPSCs定向肝窦内皮细胞分化中的功能及机制研究

Because of the absence of coagulation factor FⅧ, the treatment of hemophilia A has been a major challenge. Hepatic sinusoidal endothelial cells (LSECs) have the potential to secrete high level FⅧ. Our previous studies have shown that transcription factor GATA4 can regulate the differentiation of LSECs. Inducing the differentiation of human iPSCs into LSECs through GATA4, which brings new ideas for the treatment of hemophilia A. So we intend to carry out our study as below : 1) At the cellular level, study the expressions of GATA4 and FⅧ in different types of endothelial cells, and the effect of GATA4 on the differentiation of human iPSCs to LSECs; 2) At the animal level, study the survival and regeneration of LSECs derived from iPSCs induced by GATA4 in hemophilia A mice, and the long-term secretion of FⅧ of LSECs; 3) At the molecular level, explore whether GATA4 regulates the differentiation of human iPSCs into LSECs through the TGFβ/activin signaling pathway. The aim of this study is to obtain LSECs with long-term high secretion of FⅧ by induction of autologous human iPSCs from hemophilia A patients, laying a theoretical and experimental foundation for cell and gene therapy of hemophilia A, which has certain clinical application prospects.

由于凝血因子FⅧ的缺失，血友病A的治疗一直是临床治疗的重大挑战。肝窦内皮细胞（LSECs）具有高分泌FⅧ的潜能，我们前期研究表明，转录因子GATA4可调节LSECs分化。通过GATA4诱导人iPSCs定向LSECs分化，为血友病A的治疗带来新的思路。本项目拟研究：1）细胞水平上，明确不同类型的内皮细胞GATA4及FⅧ的表达情况；研究GATA4对人iPSCs来源的LSECs分化及功能的影响；2）动物水平上，研究GATA4诱导来源的LSECs在血友病A小鼠体内再生情况及长期分泌FⅧ的能力；3）分子水平上，以TGFβ/activin信号通路为切入点，探索GATA4调节人iPSCs向LSECs分化的分子机制。本课题旨在应用血友病A患者自体来源的人iPSCs，通过定向LSECs诱导分化，获得长期高分泌FⅧ的内皮细胞，为血友病A的细胞及基因治疗奠定理论和实验基础，具有一定的临床应用前景。

项目背景：凝血因子FⅧ的缺失是血友病A临床治疗的重大挑战。肝窦内皮细胞（LSECs）具有高分泌FⅧ的潜能，而转录因子GATA4可调节LSECs分化。 因此通过GATA4诱导人iPSCs定向LSECs分化是血友病A治疗的新策略。此外，在血友病A患者的替代治疗过程中，FVIII抑制物的产生是一种严重的并发症，然而，FVIII抑制物只发生在20-30%的重症血友病A患者中，原因至今不明。因此明确血友病A患者出现抑制物的分子机理是提高替代治疗疗效的重要途径。..研究内容：1，本项目前期按照原计划进行，比较了GATA4及凝血因子FⅧ在不同类型的内皮细胞中的表达情况；检测了GATA4对人原代LSECs分化及功能的影响；检测了GATA4对hiPSCs来源的LSECs分化及功能的影响。2，基于RNA测序（RNA-Seq）和全基因组亚硫酸氢盐测序分析（WGBS）探索FVIII抑制物形成的风险因素。..重要结果及数据：1，相比hiPSCs来源内皮细胞，人原代LSECs的GATA4基因表达升高，F8基因的表达及分泌水平升高，但在原代LSECs及hiPSCs来源内皮中GATA4对F8基因的表达及分泌水平均无显著影响。2，利用RNA-Seq 和WGBS分析 17例内含子22倒位患者的样本，其中包括7例抑制物阳性患者和10例抑制物阴性患者。我们共发现344个mRNA转录本和20个lncRNA转录本的差异表达。在差异表达的转录物中，200个mRNAs和12个lncRNAs上调，144个mRNA和8个lncRNA下调。差异表达mRNA的基因本体富集分析表明，参与免疫激活的基因，尤其是T细胞活化的基因被上调，而参与负免疫应答调节的基因被下调。共表达分析显示，差异表达lncRNA的靶向上调基因与免疫激活，尤其是T细胞激活密切相关。甲基化分析显示，抑制剂阳性患者在CpG岛、5′非翻译区和外显子区的甲基化状态稍低（p < 0.01），具有差异甲基化区域的基因也与T细胞活化相关。..科学意义：明确了GATA4对F8基因的表达及分泌水平的影响；阐明了血友病A患者出现抑制物的潜在分子机理：在抑制剂阳性的血友病A患者中，参与免疫系统激活的基因上调，lncRNA和甲基化修饰可能在抑制剂产生中发挥重要作用，这些发现有可能揭示预防和治疗抑制剂产生的治疗新靶点。

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