肌营养不良基因诊断及新突变致病性研究

Muscular dystrophy (MD) is a group of inherited muscular diseases. The clinical symptoms, signs, biochemistry, immunohistochemistry technology, especially the genetic detections are helpful to make the diagnosis, genetic counseling and prognosis for MD. We have collected 160 suspected patients. Genetic diagnoses have been made for 149 patients, 8 different types MD were found, and novo mutations were found in 16 patients. However, the genetic pathogenesis of 10 suspected patients are still unknown. Meanwhile, the pathogenicity for most of 16 novo mutations was analyzed and supported by cosegregation analysis, bioinformatics software. Moreover the pathogenicity and pathogenic mechanism of two novo mutations had been confirmed by the results of immunohistochemistry, cell culture, real time PCR, TA cloning and gene sequence. We plan to continue our study in a larger population and improve the diagnostic strategies. Gene replacement， cell transfection and genetic expression analysis will be used to analyze the pathogenesis of the novo mutations. As occasion requires, whole genome sequencing and RNA sequencing techniques will be used to search for possible pathogenetic gene. We aim to identify mutation hot spots of different forms of MD, and to learn the pathogenicity of novo mutations, so as to provide a theoretical basis for accurate genetic counseling and even gene therapy.

肌营养不良（MD）是一组遗传性肌肉疾病，综合分析症状、体征、生化、免疫组化、相关基因检测等结果是MD确诊、预后及遗传咨询的依据，本课题组前期运用上述方法对160个疑诊MD病人进行分析，在基因水平上证实149个先证者分别为8种不同的MD，1例确诊为非MD，但仍有10例病人的致病基因未知； 16个新突变的致病性通过家系共分离分析、生物信息学软件预测得到了支持，应用免疫组化、肌肉细胞体外培养、荧光定量PCR、T-A克隆、基因测序等方法进一步确认其中2个新突变的致病性，并初步探索了其致病机制；本课题组拟继续扩大研究对象，并引入基因置换、细胞转染、基因表达分析等遗传工程技术加深对新突变生物学功能及致病机理的研究；并运用全基因组测序、RNA测序等技术探索疑难病例的致病基因；总结广西地区不同类型MD病人基因突变特点，明确新突变的致病性，为精准遗传咨询乃至基因治疗提供理论依据。

本研究以疑诊肌营养不良病人为研究对象，应用MLPA、一、二代测序、RT-PCR、qPCR、细胞培养、基因敲除、细胞转染、免疫组化、Western-Blot、生物信息学、磁共振成像、实验病理学与成像技术等进行研究，主要完成下列工作：.1.对331例病人完成MLPA检测DMD基因外显子及肌病panel二代测序或全外显测序，总结出广西地区肌营养不良基因的突变谱如下：广西地区MD患者以DMD/BMD为主，突变类型多为大片段缺失/重复，其次为点突变。DMD缺失突变主要位于45-55号外显子，重复突变主要位于DMD基因的5’端和3’端，点突变以无义突变为主。.2.发现了52个未报道过的新突变位点，43个位于DMD基因，9个位于非DMD基因。本研究分别报道了COL6A2、LMNA、PLEC基因上的3个新发突变，阐明其致病性及致病机理，扩充了基因突变谱。.3.首次报道一个家系中两例患者为复杂基因组重排所致的罕见型Xp21邻近基因缺失综合征，母亲与两个姐姐为携带者，并阐明致病机理。.4.应用小剂量糖皮质激素治疗对50例DMD患者的病情具有延缓或改善作用。.5.MD亚型的肌肉受累具有不同的MRI表现，DMD肌肉脂肪浸润累计评分与临床指标存在相关性，临床可借助MRI明确肌肉受累情况和进展变化。.6.DMD患儿、DMD/BMD携带者的血清肌特异性miRNAs表达水平较正常对照均有增高，miR-499与miR-208b能很好地区分患儿与健康儿童，miR-133b与miR-499是携带者潜在可用的生物标记物。miRNAs不仅具有诊断DMD的能力，还能反应DMD患儿肌肉的病理状态。.7.总结57例DMD携带者X染色体失活模式，初步证明X染色体失活模式与DMD携带者临床表型没有相关性。.8.应用ddPCR和超深度测序明确1例肌营养不良嵌合体遗传学身份，评估两种检测方法临床应用的可行性，初步制定有效可行的肌营养不良嵌合体诊断策略。.综上，本项目为纳入的广西地区MD病人明确了病因，对新发突变的致病性及机理进行了验证，扩展了基因突变谱。此外，我们探索了X染色体失活模式与DMD携带者致病机制的关系；初步制定MD嵌合体诊断策略；发现miRNAs是DMD患者、DMD/BMD携带者潜在的生物标志物；评估了临床应用激素治疗DMD的效果；探索了MRI在MD病人中的应用；为临床诊治MD病人提供了新的思路。

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