溶血性曼氏杆菌羊分离株白细胞毒素（LKTA）与CD18结合域的确定及小分子抑制剂的筛选

OBJECTIVE: To determine the binding domains of LKTA and its receptor β2 integrin subunits (CD18) of Mannheimia haemolytica Serotype A1 and A2 by co-immunoprecipitation and laser confocal microscopy; to combine homology modeling and molecular docking simulation software systems for screening Mannheimia haemolytica novel small molecule inhibitors. SIGNIFICANCE: The pathogenicity of Serotype A1 and A2 of Mannheimia haemolytica to sheep is different. Apart from its own genetic sequence, it may also be related to the different binding sites of the corresponding receptors. The development of this study will be lay the foundation for the in-depth study of the pathogenic mechanism of Serotype A1 and A2 of Mannheimia haemolytica; traditional vaccines have limited effects, and Mannheimia.haemolytica has developed resistance to various drugs, so the development of novel small molecule inhibitors can serve as the starting point for new disease treatment. METHODS: Co-immunoprecipitation combined with laser confocal in vitro assays; homology modeling combined with molecular docking on-line simulation software. INNOVATION: Testing In vitro combined with online simulation software was used to determine the possible binding domains of LKTA and its receptors in Mannheimia haemolytica; the small molecular inhibitor of Mannheimia haemolytica against hemophilic CD18 was simple in structure and could synthesis in vitro ,more economical and more environmentally friendly, may replace the role of traditional vaccines.

目的：通过免疫共沉淀及激光共聚焦试验确定溶血性曼氏杆菌A1及A2血清型LKTA与其受体β2整合素亚单位（CD18）结合域；结合同源模建及分子对接软件模拟系统，筛选溶血性曼氏杆菌新型小分子抑制剂。意义：A1和A2型溶血性曼氏杆菌对羊的致病性不同，除了与其自身的基因序列有关，可能还与其和相应受体的结合位点不同有关，本研究的开展将对A1和A2型溶血性曼氏杆菌致病机理深入研究奠定基础；传统疫苗作用有限，而且溶血性曼氏杆菌对多种药物产生了耐药性，开发新型小分子抑制剂可以作为新的疾病治疗的切入点。方法：免疫共沉淀结合激光共聚焦的体外试验；同源模建结合分子对接的在线模拟软件。创新点：首次采用体外试验结合在线软件模拟相结合的方法，确定溶血性曼氏杆菌LKTA与其受体可能的结合域；针对羊源CD18筛选的溶血性曼氏杆菌小分子抑制剂结构简单，可以体外合成、更经济、更环保，可能代替传统疫苗的作用。

项目的背景：.由放牧转变为圈养的过程中，由于饲养环境和养殖方式的改变，一些羊传染病发生的风险在大大增加，突显的问题主要表现在以呼吸系统疫病多发，溶血性曼氏杆菌是该类疫病的主要病原之一。该病原单独及与其他病原菌、病毒等混合感染，均会引起发病，且致死率很高，对养殖业造成巨大的经济损失。然而，溶血性曼氏杆菌对多种药物产生了耐药性，且目前尚无商品化疫苗，加之传统疫苗的作用有限，因此，基于现阶段小分子化合物的诸多优点，开发可用于治疗或预防该病的新型小分子抑制剂可以作为新的疾病治疗的切入点。.主要研究内容：.1）运用激光共聚焦显微镜观察结合用免疫共沉淀方法检测，初步确定LKTA（A1 和 A2 血清型）与 CD18 可能结合域。.2）运用同源模建结合分子对接的在线预测，同时结合免疫共沉淀结果中预测的结合域进行综合分析，并对比溶血性曼氏杆菌 A1 和 A2 血清型的结合域， 从数据库中筛选得分较高的小分子抑制剂。.3）通过体内及体外抑制活性试验初步确定有效的小分子抑制剂。.重要结果：采用体外试验结合在线软件模拟相结合的方法，确定了溶血性曼氏杆菌LKTA与其受体可能的结合域并筛选到了5个代表性小分子化合物，通过表面等离子体共振（SPR）实验筛选到了1个亲和力最好的小分子抑制剂，可作为后续新药研究的基础。.关键数据：.1)通过该项目的实施，确定了LKTA1（A1血清型）与羊 CD18 可能结合域为LKTA蛋白的0-100、200-300、500-600、600-700氨基酸区域；羊源CD18 与溶血性曼氏杆菌LKTA2（A2血清型）蛋白的结合关键部位为600-700氨基酸区域。.2)通过采用同源模建、分子对接技术结合免疫共沉淀实验结果，最终人工筛选到得分最高的5个小分子抑制剂。.3)利用表面等离子体共振技术（SPR）技术，体外筛选到1个体外抑制活性较好的小分子抑制剂。.科学意义：.溶血性曼氏杆菌（A1和A2型）对羊的致病性不同，除了与其自身的基因序列有关，可能还与其和相应受体的结合位点不同有关，本研究的开展将为A1和A2型溶血性曼氏杆菌致病机理深入研究奠定基础；传统疫苗作用有限，而且溶血性曼氏杆菌对多种药物产生了耐药性，开发新型小分子抑制剂可以作为新的疾病治疗的切入点。

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