磷酸化修饰膜联蛋白MtAnnexin2调控苜蓿耐盐性的分子机理

In animals, phosphorylation of Annexin proteins prevents their binding to phospholipid by changing the conformation. For plant Annexins, its involvement in stress tolerance has been proven in several species. The molecular mechanism of Annexin phosphorylation in plant response to adverse conditions, however, has not been documented. Our previous study showed that ectopic expression of alfalfa MsAnnexin1 improved tolerance of the transgenic Arabidopsis to salinity. This project will focus on the effects of phosphorylation status at threonine 3 (Thr3), a conserved kinase target site at N-tail terminal of Annexins, on salt tolerance in Medicago truncatula. Molecular techniques including CHRISPR/cas9 and Co-IP will be performed to investigate the following aspects: (1) the effects of phosphorylation MtAnnexin2 on root development; (2) the effects of MtAnnexin2 phosphorylation on NaCl stress and salt-response signaling pathway; (3) the involvement of α-kinase in the regulation of salt tolerance by phosphorylating MtAnnexin2 at Thr3. The findings of this research will reveal the molecular mechanism of phosphorylation at Thr3 of MtAnnexin2 in modulating salt tolerance and provide a theoretical basis for breeding high-salinity resistant germplasm using molecular techniques, which may broaden our understanding of epigenetics in plant resistance to environmental stresses.

动物细胞中，膜联蛋白Annexins通过磷酸化修饰改变构型影响与磷脂的结合。植物Annexins的研究集中于改善抗逆性的应用方面，对磷酸化Annexins调控抗逆的机制尚未报道。我们对紫花苜蓿MsAnnexin1的研究表明，超表达MsAnnexin1能增强植物耐盐性。本项目针对植物Annexins特异磷酸化位点Thr3，围绕磷酸化Annexins影响苜蓿耐盐性的科学问题，以截型苜蓿为材料，采用CHRISPR/cas9和蛋白免疫共沉淀等技术, 重点研究：（1）磷酸化MtAnnexin2对苜蓿根系生长发育的影响；（2）磷酸化MtAnnexin2对苜蓿响应NaCl胁迫及盐信号途径的影响；（3）α-激酶对MtAnnexin2调控苜蓿根系耐盐性的作用。本研究将从分子水平上阐明磷酸化修饰膜联蛋白Annexin2调控苜蓿耐盐性的作用机制，拓展植物抗逆领域的表观遗传学研究，为苜蓿耐盐分子育种提供理论依据。

随着生活水平的提高，人们对动物蛋白产品的需求逐年增加，草食动物饲养数目快速上升，导致对饲草的需求量急剧增加。我国耕地面积有限、盐碱地分布广、面积大，开发利用盐碱化程度高的边际土地种植紫花苜蓿已经成为饲草生产的主要方向。膜联蛋白Annexins是一类进化保守的多基因家族蛋白，广泛参与植物抗逆过程，但目前苜蓿膜联蛋白在盐胁迫中的功能及作用机理尚未报道。项目研究了植物特异蛋白激酶PSCK介导的苜蓿MtAnnexin2磷酸化对盐响应的影响。研究发现，苜蓿MtAnnexin2促进侧根形成，Annexin2的表达水平与植物的耐盐性正相关。超表达MtAnnexin2的植物在NaCl（200 mM）处理下，长势优于野生型，电导率显著低于对照，存活率提高约20% - 40%。该结果表明MtAnnexin2是重要的盐应答正调控基因。核蛋白PSCK具有激酶活性，定点突变获得的不同磷酸化状态膜联蛋白MtAnnexin2的植株经盐处理后，突变单个磷酸化位点的材料与对照差别不明显，四个位点突变的去磷酸化膜联蛋白Annexin2-4A植株对盐处理的敏感性增加，过磷酸化膜联蛋白Annexin2-4D植株叶片细胞内Na+浓度低于对照。同时，MtAnnexin2的磷酸化水平与盐应答基因HKT1和NHX1表达量正相关。我们推测，激酶PSCK介导的膜联蛋白MtAnnexin2磷酸化通过影响HKT1和NHX1信号通路维持胞质内Na+ 浓度的稳态，进而实现对植物耐盐性调控的分子机理。项目不仅为苜蓿耐盐育种提供了重要的靶基因，而且为表观遗传修饰在植物抗性育种领域的应用提供了理论支持，对培育耐盐苜蓿新品种，提高盐碱地利用率，改善生态环境，实现绿色可持续发展的新型畜牧业具有重要意义。

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