基于植物病毒载体的无转基因CRISPR-Cas定向编辑技术建立和应用

Targeted genome editing technologies mediated by CRISPR-Cas nucleases promise revolutionize crop genetic improvement practices. Current targeted plant genome editing approaches rely on the sequence-specific nucleases to be delivered through a transgene and be integrated into plant genome. Although the nuclease and selection maker transgenes can be segregated from the edited target gene by genetic crossing, this transgenic approach may incur public and regulatory concerns about genetically modified organisms, thus limiting the use of genome editing in agriculture. Therefore, transgene-free delivery of CRISPR nuclease to implement highly efficient targeted genome editing will pave the way for the widespread use in plant biotechnology and agriculture. Preliminary studies from the PI’s lab showed that a high capacity plant rhabdoviral vector was capable of carrying the Cas9/sgRNA expression cassettes and mediating targeted editing of a host gene. In this proposal, we aim to establish highly efficient targeted genome editing method in Nicotiana benthamiana plants by using virally-delivered Cas9 and Cpf1 editing reagents. First, the editing efficiency will be improved by processing the guide RNAs either by ribozymes, or by utilizing tRNA processing enzymes or Cpf1 self-processing, and on the basis of this approaches, multiplex genome editing may be established. Tissues from systemic leaves of virus infected plants will be used to regenerate plant seedlings with edited target genes that are free of transgene and virus, and the inheritance and stability of mutations in T1 and T2 generations will be investigated. Potential off-target effects and the adaptability to other viral hosts will be assessed and evaluated. This proposed studies hold great promise for developement of a novel DNA-free targeted plant genome editing approach that should benefit crop improvement.

CRISPR-Cas核酸酶介导的定向基因组编辑技术有望革命性改变作物遗传改良实践，但当前植物基因组编辑主要依赖于以转基因形式导入核酸酶，制约了该技术在育种中应用。发展无转基因的CRISPR核酸酶高效递送方法和定向编辑技术体系，有助于推进作物精准育种产业化进程。项目组前期研究发现，一种植物弹状病毒载体可用于高效递送CRISPR-Cas9核酸酶并特异性编辑靶标基因。本项目拟在此基础上，建立基于病毒载体的CRISPR-Cas9/Cpf1核酸酶导入方法，并通过优化向导RNA的转录后精确加工以提高编辑效率，并发展多靶标编辑技术；通过对病毒系统侵染的组织进行植株再生，明确靶基因突变的可遗传性，获得无外源DNA、无载体病毒的编辑植株后代；探明病毒载体介导的基因组编辑的特异性和适用寄主范围等，建立基于植物病毒载体的无DNA高效基因组编辑技术体系，为我国作物种质创制提供技术支撑。

CRISPR/Cas基因编辑技术已广泛应用于植物基础生物学研究，并为作物精准改良提供了前所未有的机遇。然而，CRISPR/Cas元件高效递送方法的缺乏，以及编辑植株再生所面临的技术困难，是制约这些革命性技术在农业中广泛应用的主要技术瓶颈。虽然核酸酶分子工具仅需短暂地存在于细胞内便可完成靶向基因修饰，但由于植物细胞壁结构的阻碍，当前通常依赖于稳定整合的转基因进行植物递送。稳定转化仅对有限数量的作物物种及品种有效，且技术门槛高、转基因分离周期长、对植物基因组和表观组存在潜在影响。作为一种天然的基因递送纳米材料，病毒载体受到广泛的关注。然而，目前普遍使用的CRISPR/Cas核酸酶及衍生分子的编码序列长度远超出绝大多数植物病毒载体的承载上限（< 1-2 kb），限制了植物病毒载体在基因编辑元件递送中的用途。在本项目的资助下，项目组利用一种负链RNA弹状病毒—苦苣菜黄网病毒（Sonchus yellow net virus, SYNV），发展了可系统递送完整的CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a组份的病毒载体，并在模式植物本氏烟上实现了高效的非转基因基因编辑。将病毒产生的体细胞编辑通过组织培养可获得含有靶向突变的再生植株，突变基因的传递符合孟德尔遗传定律。进一步，基于一种广寄主范围的番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）建立了瞬时递送系统，并用于向多种作物不同品种稳定递送一系列大的CRISPR/Cas核酸酶分子，包括CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas12a，腺嘌呤碱基编辑器和胞嘧啶碱基编辑器。研究者发展了通过组织培养高效产生含有可遗传突变的植物的技术流程，并结合抗病毒化学治疗脱除病毒载体。本研究发展的病毒递送系统具有简易、稳定、高效、广谱、安全可控等优点，有效突破了植物遗传修饰中的基因递送技术瓶颈，为众多难以转化作物的基因组编辑提供了一种有前途的解决方案，可望推动基因编辑技术在相关作物基础研究和育种中的应用。

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