活细胞内核酸修复酶的实时荧光成像方法研究

DNA repair enzymes play important roles in the recognition and repair of DNA lesions. The aim of this project is to develop effective probes for in-situ fluorescent imaging of DNA repair enzymes in living cells. Sensitive and specific probes for DNase I, 3'-5'exonuclease, 5'-3' exonuclease and abasic-site repair enzyme will be designed and synthesized. The structures of the probes will be optimized to enable them function in living eukaryotic cells. Different approaches to facilitate the probes to enter the cells will be tested and compared. Hela cells and Arabidopsis thaliana cells will both be tested. The assays will be applied to study the distribution and variation of cellular enzymes under different external stimuli conditions. They can also be used to probe the biological regulation of DNA repair pathways and to study the mechanisms of enzymatic reactions.In addition, simultaneous fluorescent imaging of multiple DNA repair enzymes in living cells will be investigated. The results of this project will provide useful information and powerful tools as well for life science research, disease diagnosis and screening drug candidates.

核酸修复酶在核酸损伤的识别和修复过程中发挥着至关重要的作用。本项目拟在近几年积累的工作基础上，系统研究活细胞内核酸修复酶的实时荧光成像分析方法。将在已初步构建的非限制性内切酶的探针基础上，进一步以3'-5'和5'-3'核酸外切酶及核酸脱碱基修复酶作为目标物设计合成专一识别目标酶、抗干扰能力强的核酸荧光探针，并通过详细对照研究，确定不同探针导入动物细胞和植物细胞的最佳方法，实现活细胞中目标酶的原位荧光成像，获得丰富的时空分布信息，并研究在不同外界作用下，细胞内酶的相应变化和相关活性物质的相互作用和转化机理。在上述研究基础上，本项目还将初步探索活细胞内多种酶的同步实时荧光成像观测方法，为生命科学研究、疾病诊断和药物开发等提供重要的科学依据和有力的研究手段。

核酸修复酶在核酸损伤的识别和修复过程中发挥着至关重要的作用。由于细胞内多种核酸酶共存的复杂环境，给在活细胞内直接原位观测其中某种特定核酸修复酶的空间定位和活性变化造成很大困难，也制约了对核酸损伤修复过程动态变化的实时跟踪。在本项目中，我们探索了两种研究策略，一是直接对核酸底物进行化学修饰，研究自由溶液中不同蛋白对核酸分子上不同修饰结构的响应规律；另一个是利用纳米材料作为反应界面，研究当对纳米材料表面进行不同的化学修饰时，蛋白-核酸相互作用的变化规律。在第一种策略指导下，我们成功合成了一系列具有杂合结构的单分子荧光探针，实现了核酸脱碱基修复酶（APE1）、3' 外切酶、5'外切酶和非限制性内切酶等的专一性检测。既可以用于一步快速高通量检测血清中核酸损伤修复酶的活性，又可以用于细胞内核酸酶活性的原位成像。在第二种策略指导下，我们首次揭示出了APE1与亲和素分子之间特异性的强相互作用，利用此性质，我们成功开发出了可以对活细胞中APE1进行实时荧光成像的纳米荧光探针，为在活细胞内原位观测核酸损伤的修复过程和分子机理提供了有力的方法学工具，也解决了领域内有关纳米颗粒表面可以抑制核酸酶降解核酸机理的部分存在争议的问题。上述两种探针设计思路还具有良好的普适性，可以推广至开发更多核酸修复酶的荧光探针。由于核酸损伤修复酶在细胞内以及血清中的活性异常与很多疾病密切相关，而且在制定治疗方案和预后方面可提供重要的参考信息。同时，核酸损伤修复酶还可作为癌症治疗的靶点，通过筛选其抑制剂作为药物，达到靶向性治疗的目的。因此本项目的研究成果在临床诊断和癌症治疗方面均具有良好的实际应用前景。项目迄今已正式发表论文7篇，其中SCI收录的国际期刊论文5篇，影响因子都在6.0以上。另外还发表了2篇中文核心期刊文章。项目获正式授权发明专利3项。共培养博士研究生7名，其中5名已毕业并获得博士学位。

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