基因工程化噬菌体纳米纤维调控诱导多潜能干细胞向心肌细胞分化的研究

Cardiac muscle cells (cardiomyocytes) are terminally differentiated cells, which are incapable of regenerating and repairing themselves. Hence injury and apoptosis of cardiomyocytes will lead to myocardial infarction (MI) disease. An effective strategy for MI treatment is to first induce the differentiation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) into cardiomyocytes, and then transplant the resultant cardiomyocytes into the injured heart muscle. However, the traditional methods for inducing the differentiation are inefficient. The addition of bone morphogenetic protein-4 (BMP-4) and Activin-A is found to facilitate the iPSCs’ differentiation into cardiomyocytes, but these recombinant proteins are extremely expensive. M13 phage, a type of human-safe biological nanowires, can display foreign peptides on the surface by genetic engineering. Therefore, this project will take advantage of a technique called biopanning to identify peptides possessing a high similarity to the functional domains of the two proteins (BMP-4 and Activin-A) and then genetically single- or double-display the peptides on the phage surface. These engineered phages will then be assembled into biofilms with a unique topography, which can precisely and efficiently induce iPSCs differentiation into cardiomyocytes. Finally, the iPSCs-derived cardiomyocytes will be injected into the heart of a MI mice model to repair the infarcted heat. Different from the conventional strategies for inducing stem cell differentiation, the use of genetically engineered phage biofilms in this project represents a novel approach to regulating the differentiation of iPSCs into cardiomyocytes. The successful completion of this project will provide experimental supports and lay the foundation for the eventual goal of clinically treating MI.

因心肌细胞属于终端分化细胞，不具备足够的再生和自我修复能力，心肌细胞损伤及凋亡会导致心肌梗死疾病（MI）。目前，通过把诱导多潜能干细胞（iPSC）先分化成心肌细胞后移植入心肌受损部位是治疗MI的一种有效方法。然而，传统方法诱导分化效率低。通过添加骨形态发生蛋白-4和激活素-A能提高向心肌细胞分化效率，但这二种重组蛋白价格昂贵。M13噬菌体是一种对人体无害的生物纳米线，其表面可通过基因工程展示外源多肽。因此，本项目将利用生物淘选技术筛选出与上述二种蛋白功能区相近的多肽，通过基因工程将多肽单或双展示在噬菌体表面，将其组装成具有特定拓扑结构的生物膜，来精确、高效调控iPSC向心肌细胞分化，并将iPSC来源的心肌细胞用于MI小鼠的心脏修复。本项目突破调控干细胞分化的传统思路，开拓采用基因工程化噬菌体调控iPSC向心肌细胞方向分化的新方向，为实现在临床上进行MI治疗的最终目标提供实验依据和奠定基础。

心肌梗死(MI)患者体内存在大量坏死和凋亡的心肌细胞，终端分化的心肌细胞没有足够的再生和自我修复能力，导致MI患者较高的死亡率。通过在体外将诱导多功能干细胞（iPSCs）分化成心肌细胞后用于心肌细胞坏死区细胞的更换是一种有效的治疗MI疾病的手段，然而传统的体外诱导方式成本较高，且效率难以达到预期，限制了这种方法的应用。.BMP4和Activin A是两种在心脏发育过程中起关键作用的细胞因子，已被证实能够提高多功能干细胞向心肌细胞分化的效率。我们以此为出发点，利用Biopanning技术找到了能够代替价格昂贵的细胞因子的功能化多肽片段，并将对人体无毒无害的M13噬菌体纳米纤维引入到心肌疾病的治疗中，制备了工程化噬菌体膜，并用于诱导iPSCs 向心肌细胞定向分化的研究。首先利用噬菌体展示多肽文库，以BMP4和Activin A受体蛋白BMPR-IA和ACTR-IIB为靶标，筛选并验证了能够和BMPR-IA和ACTR-IIB结合的亲和多肽。进一步，采用生物信息学分析筛选得到的亲和多肽分别和BMP-4与Activin A的相似程度，确定了能够代替BMP-4与Activin A的功能多肽。利用噬菌体展示技术，我们把筛选到的BMP-4与Activin A类似肽分别以及共同展示到M13噬菌体的pVIII蛋白上，得到了单展示和双展示的基因工程化噬菌体。以三种工程化噬菌体纳米纤维为主要原料，我们研究了利用提拉法来构建有序结构的生物膜的工艺，发现噬菌体浓度和提拉速率可以调控噬菌体膜的结构，并得到了具有多层级（纳米-微米）结构有序组装的基因工程化噬菌体膜。最后，利用构建的这种有序结构的噬菌体膜，我们研究了基因工程化噬菌体对iPSCs向心肌细胞分化的影响，验证了筛选得到的亲和多肽的心肌诱导分化功能。.本项目首次将噬菌体相关技术引入到心肌疾病治疗中，实行了基因工程技术，细胞生物学和生物材料学的交叉研究，找到了可以诱导iPSC分化成心肌细胞的多肽序列，解决现有方法中使用昂贵的生长因子而分化效率低的难题，同时阐释了运用细胞生长因子及有序结构的生物膜来调控iPSCs向心肌细胞分化的效应机制，为今后临床上治疗MI疾病提供了新的参考手段。

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