青海血蜱唾液腺内凝血因子FⅡa/FXa结合蛋白的筛选鉴定

结题报告
项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号:
    81760375
  • 项目类别:
    地区科学基金项目
  • 资助金额:
    33.0万
  • 负责人:
  • 依托单位:
  • 学科分类:
    H2205.传染病媒介生物
  • 结题年份:
    2021
  • 批准年份:
    2017
  • 项目状态:
    已结题
  • 起止时间:
    2018-01-01 至2021-12-31

项目摘要

Ticks are obligatory blood feeding ectoparasites of human beings and animals. To acquire a blood meal continuously for as long as two weeks or even longer, tick salivary glands secrete a variety of biologically active molecules to overcome haemostatic responses of the host. Identification of biologically active molecules binding to coagulation factors in the blood of their hosts and investigation of the interactions between those molecules and coagulation factors could explain the mechanism of tick anticoagulation, and it could also provide new ideas for developing novel therapeutic agents for cardio-vascular diseases and offer candidate antigens for researching anti-tick vaccines as well. Potential coagulation factor Ⅱa/factor Xa-binding proteins will be screened from a cDNA library constructed from salivary glands of Haemaphysalis qinghaiensis ticks with commercialized FⅡa (thrombin) and FXa and their corresponding antibodies or (and) chromogenic substrates as well. Recombinant proteins encoded by the screened positive clones will be expressed in Escherichia coli or Pichia pastoris and further be purified. The molecular structures and sizes will be determined by non-denaturing PAGE, protein sequencing and MS analysis. Inhibition effect of the prepared recombinant proteins on FⅡa, FXa, the tenase and prothrombinase complexes will be evaluated. In addition, a series of tests will also be carried out to analyzed the anti-coagulation and anti-tick immunization effects exhibited by the obtained proteins in vitro and in vivo. The finding of these biologically active proteins might help us to clarify the molecular mechanism of modulation of the host coagulation system by H. qinghaiensis.
蜱是人和家畜体表的一种吸血外寄生虫,为了在长达两周或更长的时间内持续吸食宿主血液,其唾液腺会分泌能够抑制血液凝固的活性分子,以阻止宿主血液凝固。发现蜱唾液腺内与宿主凝血因子相结合的生物活性分子并探讨这些分子与宿主凝血因子间所发生的相互作用,可初步阐释蜱抑制宿主血液凝固的分子机理,也可为开发新型抗凝血药物和研制抗蜱疫苗提供新的思路。本研究将利用凝血酶和凝血因子Ⅹa及其抗体或(和)生色底物筛选青海血蜱唾液腺cDNA表达文库,获得阳性克隆。在大肠杆菌或毕赤酵母内表达阳性克隆获得重组蛋白。利用非变性凝胶电泳、N末端氨基酸测序、质谱分析等手段初步确定所获重组蛋白的分子结构,体外分析重组蛋白与凝血酶和FⅩa以及凝血因子复合物间的相互作用及对它们的抑制效果。进一步通过一系列实验手段分析重组蛋白在体内外对凝血功能的影响和抗蜱免疫效果。这些生物活性分子的发现将帮助我们初步阐明青海血蜱调控宿主凝血系统的分子机理。

结项摘要

蜱是人和家畜体表的一种吸血外寄生虫,在蜱吸血过程中其唾液腺会分泌能够抑制血液凝固的活性分子,以阻止宿主血液凝固。发现蜱唾液腺内与宿主凝血因子相结合的生物活性分子并探讨这些分子与宿主凝血因子间所发生的相互作用,可初步阐释蜱抑制宿主血液凝固的分子机理,也可为开发新型抗凝血药物和研制抗蜱疫苗提供新的思路。本研究建立了利用凝血酶和凝血因子Ⅹa及其抗体筛选cDNA表达文库的功能筛选法。利用此方法从青海血蜱唾液腺cDNA表达文库中筛选获得74个阳性克隆。将其中的26个阳性克隆(Hq001至Hq026)的基因序列登录GenBank,获取了登录号 (MN306323至 MN306348)。生物信息学分析显示,Hq001的编码蛋白含有两个典型的Kunitz结构,其产物可能为组织因子途径抑制物2(TFPI2);Hq002 的编码蛋白也含有两个Kunitz 结构,其产物与镰形扇头蜱的rhipilin-2类似;Hq003所编码的氨基酸序列内富半胱氨酸残基,且半胱氨酸残基以C-(4-5)X-C-(14-23)X-C-(11-16)的规律重复出现5次;Hq006-Hq010等的编码产物可能属于青海血蜱的免疫抑制蛋白p36家族成员;Hq012编码产物与已报道的基因序列同源性不高。其余阳性克隆暂未深入分析。将其中17个阳性克隆的蛋白编码区插入pET30a中构建了原核表达质粒。其中9个重组质粒在大肠杆菌中成功表达了目的蛋白,除一个重组质粒的表达产物可溶外,其余质粒表达的重组蛋白都以包涵体的形式存在。进一步建立了重组蛋白rHq002和rHq012的纯化方法。研究发现rHq002在体外能被凝血酶和FXa切割为小片段。rHq002能促进凝血酶、FXa、TF/FVIIa等水解其相应发色底物的活性。rHq012能促进凝血酶、FXa、TF/FVIIa、FXIIa、FXIa水解其相应发色底物的活性,该重组蛋白还能抑制前激肽释放酶和纤溶酶水解其发色底物的活性。两个蛋白都能延长正常人血浆APTT时间。初步的细胞生物学实验发现2个重组蛋白对人胚胎肾细胞HEK293、人非小细胞肺癌细胞A549和中国仓鼠卵巢细胞CHO等3个细胞株的生长形态、活力等生物学特性无影响。这些阳性克隆的发现及对其表达蛋白的深入研究,为阐明青海血蜱调控宿主凝血系统的分子机理奠定了基础。

项目成果

期刊论文数量(2)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(1)
青海血蜱重组rHq002蛋白包涵体的纯化
  • DOI:
    --
  • 发表时间:
    2022
  • 期刊:
    中国生物制品学杂志
  • 影响因子:
    --
  • 作者:
    马静;陈开廷;曹美娜;刘玉婷;马婧;高金亮
  • 通讯作者:
    高金亮
蜱Kunitz型蛋白酶抑制剂的抗凝机制研究进展
  • DOI:
    --
  • 发表时间:
    2021
  • 期刊:
    中国媒介生物学及控制杂志
  • 影响因子:
    --
  • 作者:
    马静;高金亮
  • 通讯作者:
    高金亮

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  • 通讯作者:
    李中平

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青海血蜱碱性尾巴蛋白Qinghaienin选择性抑制内源性凝血途径的作用机制研究
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课题项目:调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要:

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题,其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子,其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而,TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用,影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法,探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用,为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义,并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路:

科学问题:TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达?
前期研究:已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应,但其具体机制尚不明确。
研究创新点:本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线:包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术:TRIM2与病毒RNA的相互作用分析,IFN-β启动子活性检测。
实验模型:使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
      
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