编程可控的基因增变器及其在酿酒酵母基因组连续进化中的应用

Saccharomyces cerevisiae is one of the most commonly used cell factories for industrial production of bio-based chemicals and value-added compounds. Nevertheless, due to the complexity of metabolic and regulatory networks, genome-scale engineering or genome evolution is generally required to engineer complicated phenotypes, which are cooperatively regulated by multiple genes. To address the challenges in rapid evolution of S. cerevisiae genome, this project aims to develop a continuous genome evolution strategy for eukaryotes. The most recently developed multiplex gene regulation technique, CRISPR interference (CRISPRi), will be adopted to regulate the expression of one or several genes closely related to chromosome replication and maintenance, known as mutator genes. In this case, the mutation rate and mutation types during chromosome replication can be easily and precisely controlled by CRISPRi. In other words, the continuous genome evolution strategy is based on programable and combinatorial regulation of mutator genes and can be used to rapidly evolve a series of industrially relevant phenotypes, such as high tolerance towards low pH, high xylose utilization, and high S-adenosylmethionine production. The optimal mutation rate and mutation type as well as the synergistic interactions among various mutation types for continuous genome evolution will be studied in depth. The mutators constructed in this project can be further developed into a generally applicable strategy for continuous evolution of eukaryotic genomes.

酿酒酵母是工业生物技术最常用的细胞工厂之一，被广泛应用于生物基化工品和高附加值产品的大规模生产。鉴于生物体系复杂的代谢和调控网络，由多基因协同控制的复杂生理性状的改造往往需要通过全基因组进化的方法实现。为解决酿酒酵母基因组快速进化的问题，本项目拟发展一个适用于真核体系的基因组连续进化方法。采用最新的多基因调控技术（CRISPRi），精确调控一个或者多个同染色体复制和稳定性相关基因（即增变基因）的表达水平，构建编程可控的基因增变器，以控制基因组的突变率和突变类型，发展基于多个增变基因组合协同调控的基因组连续进化新方法。利用基因组连续进化改造酿酒酵母的低pH耐受性、木糖利用效率和S-腺苷甲硫氨酸合成水平，并在此基础上研究基因组连续进化的最佳突变率和突变类型以及不同突变类型之间的协同效应。基于本项目设计的编程可控的基因增变器，有望发展一个对真核体系普遍适用的基因组连续进化新策略。

酿酒酵母是工业生物技术最常用的细胞工厂之一，被广泛应用于生物基化工品和高附加值产品的大规模生产。鉴于生物体系复杂的代谢和调控网络，由多基因协同控制的复杂生理性状的改造往往需要通过全基因组进化的方法实现。为解决酿酒酵母基因组快速进化的问题，本项目建立了两个适用于真核体系的且编程可控的基因组连续进化方法。首先，采用多基因调控技术（CRISPRi），精确调控一个或者多个同染色体复制和稳定性相关基因（即增变基因，包括与点突变相关的MSH2、与小片段增删相关的TSA1、与中长片段增删相关的 RAD27 以及与长片段增删和染色体变异相关的CLB5）的表达水平，构建编程可控的基因增变器，以控制基因组的突变率和突变类型，发展基于多个增变基因组合协同调控的基因组连续进化新方法。其次，将非特异性的DNA单链结合蛋白（包括DNA单链结合蛋白3个亚基RFA1、RFA2、RFA3，以及引物酶PRI1、解旋酶HCS1、拓扑异构酶TOP1）与胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1，介导单链DNA以及mRNA上的脱氨基化反应）融合表达，能够在全基因组范围内随机诱发并累积C到T的点突变（随机碱基编辑器，rBE），且基因组的突变率由DNA单链结合蛋白的种类所控制，产生具有大量不同性状的酿酒酵母突变文库，以适用于不同工业性状的连续进化。最后，利用基因组连续进化改造酿酒酵母的胁迫抗性（包括异丁醇耐受性、乙酸耐受性等）、底物利用效率（包括木糖利用率）和高附加值化合物合成水平（包括类胡萝卜素合成水平），并在此基础上研究基因组连续进化的最适突变率和突变类型。鉴于DNA复制过程的保守性，基于本项目设计的编程可控的基因组连续进化策略能够适用于不同的生物体系，包括原核生物和真核生物，实验室模式菌株和工业生产菌株等，具有普遍适用性。

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