苜蓿共生结瘤体系响应重金属铜胁迫的转录组研究

以具有西部地域特征的、重金属抗性的天蓝苜蓿（Medicago lupulina L.）―-苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020）共生固氮体系为模式，应用最新发展起来的RNA-Seq 技术分别对铜离子胁迫和非胁迫条件下接种根瘤菌后天蓝苜蓿根组织中的转录本测序，通过与苜蓿全基因组的比较，分析天蓝苜蓿共生结瘤体系在铜离子胁迫和非胁迫两种生长条件下相关基因的转录表达水平及基因转录体的结构，寻找新转录本和新外显子；分析基因转录体的可变剪接种类和数量并通过qPCR验证，推测天蓝苜蓿中可变剪接的可能发生机制；分析两种培养条件下的差异表达基因并进行GO功能富集分析和KEGG代谢途径分析，从而于转录组水平上系统研究铜离子影响天蓝苜蓿与根瘤菌共生互作的分子机理，为重金属胁迫下豆科植物共生互作机制的最终阐明奠定基础。

随着全球经济的迅速发展，含重金属的污染物通过各种途径进入环境造成了严重污染，铜便是最容易进入环境的重金属之一；高浓度的Cu2+ 会对土壤生态环境、食品安全和农业可持续发展造成很大的危害，如何有效地进行铜污染土壤的生态修复是一项重要的课题。本项目即以具有西部地域特征的、重金属抗性的天蓝苜蓿（Medicago lupulina L.）―—苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti CCNWSX0020）共生固氮体系为模式，利用RNA-Seq 技术分别对铜离子胁迫和非胁迫条件下接种根瘤菌后天蓝苜蓿根组织中的转录本测序，分析基因表达、结构并注释功能；在此基础上，分析铜离子胁迫和非胁迫条件下差异表达的基因，并进行GO功能富集分析和KEGG代谢途径分析，获悉两种培养条件下天蓝苜蓿在蛋白表达、能量代谢、信号传导、生长发育等方面的差异，从而于转录组水平上系统研究铜离子影响天蓝苜蓿与根瘤菌共生互作机理。通过本项目实施，取得了以下主要结果： 完成了2个样品的转录组测序，共得到6.13Gb Clean Data，组装后获得42,389条Unigene，其中长度在1kb以上的Unigene为9,782条；对Unigene进行功能注释，包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对，共获得37,142条Unigene的注释结果；基于Unigene库的基因结构分析，获得2,359个SSR标记，同时还进行了CDS预测和SNP分析；基于基因在各样品中的表达量分析，得到3,257个差异表达基因，并对其进行了模式聚类、功能注释以及富集性分析；对部分差异表达基因进行qPCR验证，得到137个铜胁迫下表达差异较大的基因，并进一步从中筛选出61个与共生相关的基因；从已确定的与铜胁迫或共生相关的基因中挑选出42个基因，进行不同铜浓度下苜蓿根中的表达研究，并对其中10个基因进行时空表达分析；分析了不同铜浓度对根瘤菌侵染天蓝苜蓿的过程、根瘤结构及成熟根瘤固氮活性的影响，结果表明低浓度铜有利于根瘤的形成及其固氮活性的提高，而高浓度铜则对结瘤固氮起抑制作用。上述研究结果为深入研究重金属影响豆科植物共生互作分子机制奠定了基础，也为利用豆科植物---根瘤菌共生体系进行环境修复提供了理论依据。

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