杆状病毒ODV表面刺突的组分鉴定和功能研究

Baculoviruses are characterized by an infection cycle that produces two progeny phenotypes, the budded virus (BV) and the occlusion-derived virus (ODV). The ODV initiates oral infection in the midgut epithelial cells via direct membrane fusion. Previous investigations have demonstrated that at least seven per os infection factors (PIFs) on ODV surface are required for oral infection, and may function together as protein complex. In our cryo-electron tomography analysis, spikes were found on HearNPV ODV surface and its number was reduced when odv-e66 was deleted. In this study, we will further explore the component of ODV spikes and its relationship with oral infection in two aspects: 1) we will unveil ODV component by using chemical cross-linking and mass spectrum identification and immuno cryo-electron tomography technologies; 2) we will reveal the function of ODV-E66 in ODV envelopment and oral infectivity by exploiting cell and insect host infectivity assays, quantitative proteomic analysis and immuno-fluorescent observation using the ODV-E66 deleted and repaired recombinant viruses. This project is expected to reveal component of ODV spikes and its relationship with ODV oral infectivity，and thus facilitate further investigation of molecular mechanism of baculoviral oral infection.

杆状病毒ODV介导病毒的口服感染和虫体间水平传播。ODV表面有10多种膜蛋白，其中7种是口服感染必需因子(PIFs)。前期研究表明PIFs可能通过形成蛋白复合物发挥功能。我们在冷冻电子断层扫描观察中，首次发现了棉铃虫病毒ODV表面存在刺突结构，缺失膜蛋白ODV-E66会导致ODV刺突数量减少。本研究拟进一步解析ODV刺突的蛋白组成与ODV口服感染的关系：通过化学交联和质谱鉴定，以及免疫冷冻电子断层扫描观察等方法，揭示刺突蛋白组成及其与PIF蛋白复合物的关系；利用已构建的ODV-E66缺失重组杆状病毒，进行细胞和虫体水平的感染实验，结合冷冻电子断层扫描观察、质谱蛋白定量分析确定ODV-E66在ODV膜蛋白复合物形成中的作用及其与口服感染的关系。本项目预期将解析棉铃虫病毒ODV表面刺突组成及其与口服感染能力之间的关系，为深入研究ODV与宿主蛋白的相互作用奠定基础。

病毒表面刺突在病毒入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。杆状病毒ODV介导病毒的口服感染和虫体间水平传播。冷冻电子断层扫描电镜研究首次发现了棉铃虫病毒ODV表面存在刺突结构。ODV表面有10多种膜蛋白，包括主要膜蛋白ODV-E66和7种口服感染必需因子(PIFs)。我们对ODV刺突组成与功能进行了研究, 尤其是研究主要囊膜蛋白ODV-E66与spike的关系与功能。免疫电镜结果显示，ODV-E66存在与ODV外表面。转录及表达分析显示ODV-E66是一个晚期表达蛋白。使用已构建的ODV-E66缺失重组杆状病毒，进行细胞和虫体水平的感染实验，发现ODV-E66的缺失不影响出芽病毒粒子复制及ODV包埋；但严重影响病毒对大龄虫体的感染，使用能破坏围食膜的卡尔科弗卢尔荧光染色剂(Calcofluor)可使ODV-E66缺失病毒的感染力恢复至野生型病毒的感染力水平。扫描电镜观察发现，相较于ODV-E66缺失型病毒，野生型病毒感染严重破坏虫体的围食膜。体外酶活实验表明ODV-E66是硫酸软骨素酶。以上研究表明ODV-E66是可能是刺突的主要成分之一，并在通过发挥硫酸软骨酶活性破坏昆虫宿主围食膜以促进病毒接近并感染中肠。冷冻电子断层扫描电镜研究发现ODV-E66缺失会降低ODV刺突的数量与大小，且影响ODV膜的稳定性；同时根据ODV表面膜蛋白组成及大小进行分析，可推定剩余刺突主要是由口服感染因子组成。本项目揭示了棉铃虫病毒ODV表面刺突组成及其与口服感染能力之间的关系，为深入研究ODV与宿主蛋白的分子相互作用机制奠定基础，也为深入揭示ODV-E66在大DNA昆虫病毒感染中的功能机制提供了研究基础。

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