蒺藜苜蓿固氮共生过程中植物宿主通过调节LIN的表达控制根瘤菌侵染的机制

Legume plants can form a symbiotic relationship with rhizobia bacteria to obtain nitrogen nutrition. The successful establishment of nitrogen fixing symbiosis requires the coordination between nodule development and rhizobium infection signaling pathways. Through mutant screen and genetic research, the applicant discovered that in Medicago truncatula def1 (delayed nitrogen fixation 1) mutant, a deletion in the promoter region of LIN (Lumpy Infections) gene would lead to the delayed rhizobia infection phenotype, indicating that the fine-regulation of LIN expression is very important in controlling rhizobia infection. To analyze the function of LIN and its expressional regulatory apparatus, this project will perform research at 3 major aspects: (1) Characterization of the molecular function of LIN, reveal the mechanism of why altered LIN expression levels in different mutants lead to phenotype variations; (2) High-throughput screen to identify transcription factors binding to LIN promoters in wild type and def1 respectively, and confirm the transcriptional-regulating relationship between LIN and respective transcription factors; (3) Utilizing gene-editing and other research tools to investigate the molecular functions of LIN-related transcription factors in nitrogen fixing symbiosis. Research into LIN and its expressional regulatory apparatus can shed light on the mechanisms of how plant hosts specifically control rhizobia infection during nitrogen fixing symbiosis.

豆科植物可以通过与根瘤菌发生固氮共生作用来获得氮营养。固氮共生信号的传递需要根瘤发育和根瘤菌侵染通路之间的紧密协调。申请人通过突变体筛选和研究，发现在蒺藜苜蓿def1（delayed nitrogen fixation 1）突变体中，LIN（Lumpy infections）启动子区的缺失会导致根瘤菌侵染相对于根瘤发育明显滞后的表型，表明LIN的精确表达在植物宿主调控的根瘤菌侵染过程中非常重要。为解析LIN的功能及其转录调控通路，本课题将开展三方面的研究：（1）分析LIN的分子生物学功能，揭示不同突变体中LIN表达水平不同导致表型差异的分子基础；（2）高通量筛选分别与野生型或def1突变型LIN启动子区结合的转录因子，分析目标转录因子与LIN的表达调控关系；（3）阐明LIN的转录调控因子在固氮共生中的调节功能。对LIN及其转录调控机制的研究可以揭示固氮共生中植物特异调控根瘤菌侵染的机制。

豆科植物能够通过与根瘤菌的共生固氮作用获得有机氮。共生固氮过程中，在特异的植物器官根瘤内部，根瘤菌通过侵染线完全进入植物细胞，形成类细胞器结构-共生体。共生体的形成是豆科植物共生固氮反应的关键步骤。目前，共生体形成的分子机制尚不清晰。在先前的工作中，为了寻找共生体形成的关键调控基因，我们筛选了一系列蒺藜苜蓿滞后共生固氮突变体。在本项目中，我们对LIN基因调控共生体形成的机制进行了系统的研究。蒺藜苜蓿lin-5突变体表现出共生体形成推迟的表型，证明LIN基因是共生体形成的关键调控基因。lin-5突变体中LIN基因的启动子区和5’ UTR区存在着2.3 Kb的缺失，该缺失导致了突变体中LIN基因的表达模式发生变化，表现为共生固氮前期低、后期逐渐升高，同时能够在根瘤侵染区积累。对启动子各区段进行报告基因分析发现，lin-5突变体中LIN基因的表达，需要残留启动子区片段和5’ UTR区的协同作用。通过同源基因保守序列分析发现，LIN基因5’ UTR区存在一个顺式作用元件REAS，只在能够形成共生体的豆科物种中存在并且序列高度保守。基因表达模式分析和多重互补实验发现，在lin-5突变体中，REAS是LIN基因正常表达和共生体正常形成所必需的。在蒺藜苜蓿基因组中，存在着一个LIN的同源基因LINL，LIN是在LINL的基础上进化而来的。通过在不同背景的lin突变体中敲除LINL，我们发现LINL在共生体形成过程中有着独特而重要的功能。本研究系统分析了LIN基因调控共生体形成的机制，发现LIN基因在根瘤侵染区较高的表达水平是共生体形成的关键因素，同时揭示了LIN基因5’ UTR区核心元件REAS在调控LIN基因表达和共生体形成方面的核心作用。lin-5突变体可以被用作发掘更多共生体形成关键调控基因的遗传学工具，本研究为全面揭示调控共生体形成的分子网络奠定了基础。

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