基于φC31整合酶及同源重组的定点整合技术的建立及在家族性高胆固醇血症基因治疗中的应用

φC31 integrase can site-specifically mediate the integration of foreign DNA carrying attB into chromosome sites, which are called pseudo-attP sites. Previously, we found that some pseudo-attP sites can facilitate transgene expression and demonstrated that the integration rate of foreign DNA into such sites can be dramatically increased by using combination of φC31 integrase and homologous recombination in the bovine genome. In this proposal, we first systematically identify the pseudo-attP sites and investigate the distribution of the sites in the mouse genome in order to obtain a site that is more safe and benificial for transgen expression. Nextly, we combine φC31 integrase and homologous recombination and attempt to establish an integration system that target to the selected pseudo-attP site. An attB sequence is introduced at the homologous arm of targeting vector. Double strand breaks (DSBs) at the target pseudo-attP locus and donor are then simultaneously generated by φC31 integrase after co-transfected the φC31 integrase vector with the donor vector into host cells, consequently stimulating homologous recombination. Familial hypercholesterolemia (FH) is an inherited lipid metabolism disorder resulted from the defects of low-density lipoprotein receptor (LDLR) gene. Lastly, we then use the targeting system to deliver Ldlr gene into the FH model mouse (Ldlr-/-) and analyze the integration and expression in vivo and evaluate the theraputic effects. We anticipate that the non-viral site-specific integration system will provide a new platform for more safe and effective treatment in FH as well as other monogenic diseases.

φC31 整合酶可介导外源载体与染色体上的特定位点发生整合，这些位点被称为假attP位点。我们前期在牛基因组中发现某些假attP位点可支持外源基因高效表达，而且联合同源重组技术，外源DNA靶向整合到特定假attP位点上的概率能显著提高。在本项目中，我们拟首先对小鼠基因组的假attP位点进行分离并系统筛查，以获得相对安全、有利于外源基因表达的位点；接着引入同源重组机制，建立一种基于φC31整合酶及同源重组的、定向整合在该位点的系统。家族性高胆固醇血症（FH）是由于低密度脂蛋白受体（LDLR）基因缺陷造成体内脂代谢紊乱的一种遗传病。我们最后以该定点整合载体为运载工具，介导Ldlr基因在FH模型小鼠（Ldlr-/-）中整合、表达， 将其应用于FH的基因治疗研究。通过本项目，可望建立一套靶向整合的非病毒型载体系统，为基因治疗提供新的工具，同时探寻一条安全、有效的FH或其他遗传性疾病基因治疗新途径。

家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia, FH）是由于细胞膜上的低密度脂蛋白受体基因缺陷，血浆胆固醇酯的不能通过低密度脂蛋白受体进入细胞分解代谢，引起儿童期血浆胆固醇水平显著升高、皮肤肌腱出现黄色瘤和早发动脉粥样硬化等。目前对FH的治疗主要依赖于终生服用如他汀类等各种降脂类药物，但效果受个体遗传背景影响很大，而且长期的药物服用，也会带来诸多毒、副作用。基因治疗的方法可以纠正体内受损基因或代偿性表达LDLR，改善体内脂质代谢，是治疗FH的一种理想方法。本项目利用课题组前期分离出的可在肝细胞中特异表达的甲状腺结合球蛋白（thyroxine binding globulin，TBG）启动子介导外源目的基因LDLR在体外培养的细胞系以及体内肝脏中特异、高效表达；接着通过尾静脉注射的途径，以慢病毒载体为DNA运送工具，用该优化过的TBG启动子指导外源的Ldlr基因在的FH模型小鼠（Ldlr-/-）体内表达，并分析其对FH的治疗效果。结果发现Ldlr基因在体外培养的H22肝细胞系以及Ldlr-/-小鼠体内肝脏中特异表达；而且Ldlr基因的表达促进血浆脂蛋白的代谢，使小鼠血浆LDL-胆固醇下降了46 %，总胆固醇和甘油三酯分别降低28 %和30 %，极大缓解了FH症状，取得良好的治疗效果。其次，我们还利用位点特异性phiC31整合酶介导外源LDLR进行FH基因治疗研究。我们发现在phiC31整合酶的介导下，LDLR在小鼠肝细胞系中高效、持久表达；体内检测还发现LDLR在肝脏特异的甲状腺结合球蛋白启动子的作用下在肝细胞内特异表达，而且该表达明显改善血脂代谢状况，与非靶向小鼠的相比，携带attB靶向整合的LDLR可以使血浆LDL胆固醇水平降低35％左右，主动脉斑块/管腔总面积比减小了19％。该结果说明位点特异性整合的LDLR的表达，降低Ldlr-/-小鼠血浆胆固醇、改善动脉粥样硬化病变。该项目的研究对家族性高胆固醇血症基因治疗的研究进行有益的探索以及临床应用提供借鉴作用。

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