基于单细胞拉曼技术的海水固碳微生物的分选及固碳机制研究

Marine microorganisms play key roles in global carbon dioxide absorption and fixation with crucial functional genes involved. However, several bottlenecks of current technologies, e.g. incapability to detect cells in situ, in vivo and non-invasively, failure to study uncultivated cells and to bridge phenotypes with genotypes, and requirement of prior knowledge on the samples, etc., make it difficult to screen carbon fixation microorganisms and functional genes from the complex marine ecosystem. Single cell Raman spectroscopy (SCRS) is a lable-free and non-invasive technology, enabling in vivo phenotype observation without prior knowledge. A single cell Raman spectrum contains rich chemical information. In this project, based on the Raman-activated cell sorter prototype, new single cell sorting and genome amplification methods will be developed to meet various demands. Afterwards, using the seawater from Qingdao as a model system, cells which can fix carbon dioxide rapidly will be identified by combining stable isotope probing (SIP) and SCRS under in situ conditions, and their functional genes will be dissected through whole genome sequencing to reveal ‘who’ is doing carbon fixation and ‘how’. Meanwhile, the community structure are analyzed using metagenomic approaches. Finally, different enrichment temperatures and substrate (CO2 or NaHCO3) concentrations will be applied to reveal their influence on distribution of carbon fixation microorganisms and community structure by comparing to the results under in situ conditions, which can potentially provide a clue for prediction of the carbon fixation microorganisms after climate change.

海洋微生物对于全球二氧化碳吸收起重要作用，是挖掘固碳基因的巨大资源库。但目前“不能进行原位表征”、“多数微生物不可培养”、“无法将细胞种类与功能对应”、“不能实现无侵害分析”且“无法对无预先认知细胞分选”等技术瓶颈严重限制了海水中固碳微生物的寻找及功能基因解析。单细胞拉曼光谱技术具备无需标记、可监测活体细胞表型、信息丰富等优势，是理想的原位研究细胞功能的手段。本项目将在已有单细胞拉曼分选仪原型机基础上，开发适用于不同细胞的分选及基因组扩增方法，并结合稳定同位素及元基因组技术，对青岛海水中具有快速固定二氧化碳能力的微生物进行原位分选，同时解析其功能基因、固定机制及群落结构以了解是“哪些微生物”以“何种方式”参与固碳。此外，对不同温度和底物浓度条件下固碳微生物的变化进行追踪，以揭示上述两种因素对于固碳微生物的分布的影响，一定程度上为气候变化后海水固碳微生物的变化趋势提供预测依据。

海洋中富含二氧化碳吸收及固定的微生物，对于控制全球变暖起重要作用。但由于其中大部分微生物不可培养，且之前缺乏较好的原位分析海洋环境中功能微生物的手段，因此对于海水中固碳微生物的认识具有较大的局限性。本研究通过结合稳定同位素标记与拉曼单细胞技术，开发了适用于不同大小及形态的细胞的分选方法，以及针对不同特性的细胞的单细胞裂解及基因组扩增方法，同时开发算法，用于同时借助元基因组测序和基于分选细胞的mini-meta测序结果分析功能基因及代谢通路。研究成果解析了青岛崂山湾区域海水中原位实现CO2固定的微生物的种类及其相关代谢通路，发现在同一区域海水两次独立样品中包含的主要固碳微生物分别是Synechococcus spp. 和Pelagibacter spp.，而他们分别使用开尔文循环通路和还原柠檬酸循环通路进行CO2固定。同时对于不同时间及地点的海水中固碳微生物种类进行分析，发现其有显著不同。该方法学的建立为原位解析复杂微生态的功能微生物种类及对应功能基因提供了研究基础及技术支持。

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