组蛋白类泛素化neddylation修饰在DNA损伤修复中的作用及分子机制

DNA damage response and repair machinery play a critical role in maintaining genome stability, suppressing tumorigenesis and determining tumor resistance to chemo/radio therapy. After DNA damage, one main regulatory mechanism of DNA damage repair is ubiquitination modification. Meanwhile, ubiquitin like protein NEDD8 has the most homology with ubiquitin among all the ubiquitin like proteins. Recent findings reveal that histone H4 was modified by neddylation. Moreover, H4 neddylation regulated the histone ubiquitination. In this study, we will further explore the regulatory mechanisms of polyneddylation chain involved in cellular radiation-induced damage response and how neddylation affects homologous recombination repair and non-homologous end joining repair and also its detailed mechanisms. Our study is of biological significance in further understanding the mechanisms of DNA double strand breaks repair.

DNA损伤反应和修复体系在维持基因组稳定性、抑制肿瘤发生及决定肿瘤对放化疗抵抗中发挥重要的作用。DNA损伤后，损伤修复活性的重要调节机制之一是泛素化修饰。而类泛素分子NEDD8在所有类泛素分子中与泛素有最高的同源性。近期工作发现组蛋白H4在DNA损伤后发生了neddylation修饰。并且H4的neddylation修饰对组蛋白的泛素化修饰具有调节作用。本课题将探讨在细胞放射损伤反应中，类泛素分子NEDD8形成多聚链的调控机制，以NEDD8为基础的neddylation 修饰对DNA双链断裂同源重组和非同源末端接合修复活性的影响及作用机制。本研究对于进一步理解DNA双链断裂修复机制具有重要的生物学意义。

项目的背景：DNA 双链断裂损伤发生后，一组 E2泛素交联酶和 E3泛素连接酶包括 UBC13、RNF8和 RNF168被募集到 DNA 损伤位点并且泛素化组蛋白 H2A 和H2B。RNF168通过其泛素识别模序（MIU）识别 RNF8催化的早期泛素化信号，然后在此基础上利用其结构中的 RING 泛素连接酶活性将泛素化反应放大。组蛋白修饰由此将染色体疏松化以方便 DNA 修复分子在损伤位点的聚集。除此之外，组蛋白泛素化也被其他含有泛素识别结构的蛋白所识别，比如 RAP80（receptor-associated protein 80）蛋白。接下来 RAP80与 BRCA1 (breast cancer 1, early onset )组成的复合体聚集于 DNA损伤位点进行双链断裂修复。而类泛素蛋白NEDD8与泛素在蛋白序列上有57%的一致性和接近80%的同源性。同时在空间结构上两者在一些保守性氨基酸基团上也具有保守性。因此我们克隆NEDD8并将其在细胞内过表达，然后用电离辐射损伤细胞，免疫荧光染色后我们首次发现NEDD8蛋白聚集在 DNA 损伤位点，形成荧光聚点（即 foci）。首次证明了 NEDD8分子与 DNA损伤相关。进一步我们发现组蛋白H4被neddylation修饰。进而被RNF168的MIU模序识别介导下游DNA损伤反应和修复。..主要研究内容：（1）研究NEDD8第60位赖氨酸多聚链的形成（2）研究 RNF168与 NEDD8第60位赖氨酸多聚链的结合特性研究 （3）RNF168识别 NEDD8蛋白形成的 K60多聚链的生物学功能。..重要结果、关键数据：（1）NEDD8第60位赖氨酸多聚链与DNA损伤密切相关。并且发现新的修饰底物DNA-PKcs。（2）应用OctetRed分析了RNF168模序与NEDD8 K60多聚链的结合。并且发现RAP80 同样可能识别neddylation多聚链3）MLN4924抑制了NEDD8 K60多聚链形成。（4）Neddylation连接酶E3 Rbx1活化Cullin1-SCF复合体，然后泛素化EXO1，调节G1细胞周期修复通路选择。..科学意义：Neddylation与泛素化在DNA损伤修复过程中相辅相成，对于维持基因组稳定性至关重要。

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