海洋未培养甲基营养菌群驱动C1循环的微流控组学分析

The ocean harbors a wide range of methylotrophic species, which can transform C1 compounds into carbon sources and energy sources. These species are largely unknown, which have very unique microbial metabolic patterns and potential application values. Culture-independent techniques of omics have been used in conjunction with traditional culture-dependent physiological and metabolic studies of key microbial organisms to better understand how the activity of natural populations influences and regulates major biogeochemical cycles. This study will used newly developed microfluidic droplet-culture technology, combining with single-cell genome sequencing and transcriptomic analysis, to study the assimilation of C1 compounds, such as methanol and methane, driven by uncultured marine methylotrophs. We will use the Microfluidic Streak Plate (MSP) approach to isolate and revive environmental microorganisms in arrays of culturing droplets, in which they can form tiny monoclonies to provide enough copies of template genomes for establishing multiple displacement amplification (MDA) libraries. High-quality genomes of methylotrophic bacteria will be obtained by CARD-FISH probing and target genome sequencing from the MDA libraries, and their metabolic potential and inter-connected metabolisms will be illustrated. Finally, the activity of key enzymes will be analyzed in C1 metabolic modules of targeted microbes from a scaled up culture, by transcriptomic analysis and stable isotope probing. Overall, this project will combine culture-free omics analysis with high throughput single-cell culture and sequencing techniques and will lay a solid foundation for recovering marine methylotrophic species and promoting the mechanism understanding of methylotroph-driven C1 biogeochemical cycling.

海洋中广泛存在着种类和数量极为多样的甲基营养菌类群，这些类群可以将C1化合物转变为自身代谢的碳源和能源，具有非常独特的微生物代谢模式和潜在的应用价值。本研究将结合最新的微流控液滴培养技术与单细胞基因组测序、转录组分析等，研究海洋未培养甲基营养菌群对甲醇、甲烷等C1化合物的同化作用。我们将采用液滴微流控技术对原位未培养微生物进行单细胞分选与培养，使其在微滴阵列中形成单克隆微菌落、获得足够拷贝数的模板基因组，并通过单细胞扩增建立扩增子文库。采用CARD-FISH杂交与靶标基因组测序获得甲基营养菌群的高质量基因组，并分析它们的代谢潜能和潜在的互营关系。最后通过微滴放大培养与转录组分析、稳定同位素探针分析等讨论目标菌群C1代谢途径中各关键酶的活性水平。上述免培养组学技术结合高通量单细胞培养的新策略， 将为获取海洋甲基营养类群物种资源，促进对水圈微生物驱动C1生物地化学循环的机理的认识打下坚实基础。

本项目面向水圈微生物资源挖掘和利用的关键瓶颈问题，开发具有自主知识产权的单细胞单分子分析、筛选、检测新技术和新装备，实现微生物单细胞高通量分析、分选和育种，开拓研究和应用微生物的新途径。立项以来取得的主要进展概况如下：①开发了微滴阵列微生物单细胞培养技术平台，实现了大规模液滴涂布、液滴孵育和液滴提取放大等工艺流程，完成了深海沉积物等样品的单细胞培养；②建立了基于epicPCR的候选门未培养微生物互作功能筛选培养方法，从蝉蜕样本中筛选得到首株昆虫来源的候选门TM7及其共生菌组成的共生对，对TM7侵染宿主的互作机制进行了研究，发现了TM7依靠四型菌毛实现迁移和宿主定殖感染的新机制。③建立了超高通量荧光激活液滴分选（FADS）平台，实现了液滴制备，液滴皮升反应，和超高通量液滴分选；提出了无污染阶梯式皮升注射芯片设计，解决了芯片上液滴无污染反应的难题；建立了基于纳米荧光传感探针技术的通用酶活荧光检测策略，并开发了包括角蛋白、PET等在内的10余微生物酶的超灵敏荧光激活单细胞FADS分选。④研发了新型界面纳升注射单细胞全基因组测序技术装备平台，开展了微生物单细胞全基因组测序，从西南印度洋沉积物中获得100多个单细胞基因组；⑤使用13C标记甲烷实现了青藏高原若尔盖湿地样品甲烷氧化微宇宙的构建，并利用DNA-SIP和宏基因组测序，揭示了参与湿地甲烷氧化的I型甲烷氧化菌的代谢特征。⑥开发了第二代振动微滴发生技术（OsciDrop），突破了国外芯片法数字PCR的技术路线，建立了集成化、一体化的免芯片数字PCR平台，大大降低了数字PCR的使用成本，减少了手工操作步骤；初步应用于细菌、病毒的多重数字PCR检测；⑦针对微流控技术在海洋微生物学研究方面的应用撰写综述，介绍了液滴微流控技术，以及在单细胞培养、分选、测序方面的应用，并对微流控技术在海洋微生物学应用推广面临的挑战进行了分析。下一步将进一步与海洋微生物学家开展更加深入合作，结合本课题开发的培养、筛选和检测新技术，揭示海洋微生物驱动生物地球化学循环过程中的重要角色。

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