一个新的木薯AP2转录因子促进叶柄离区分化影响叶片脱落的分子机制

The Cassava (Manihot esculenta Crantz) plant has an easily observable abscission zone (AZ) structure. Cassava is a typical stress-tolerant plant that can tolerate long periods of stress conditions. The plant resists stress by shedding older leaves and forming smaller new leaves, leading to adaptive stress resistance. Ethylene signaling pathway is one of the key pathways that involved in regulating AZ differentiation. The research on Cassava AZ microarray indicted that A new AP2 transcription factor involved in the pathway of ethylene signaling and ROS signaling. In addition, GO biological process analysis, KEGG pathway analysis, promoter motif analysis, qPCR, protein and protein interaction in vitro experiments also indicated that the AP2 transcription factor participated in the regulation of AZ differentiation. AP2 transcription factors were proved to involve in the pathways of seed shedding, pathogen-resistant, stress-resistant, phytohormone response (ethylene), leaf senescence etc. In this project, we intend to obtain over expression and RNA interference AP2 transgenic cassava plants. The experiments of AZ EB staining, AZ paraffin section, AZ ethylene and ROS detection and response, AZ CHIP-seq, AZ GC-MS will be carried out to analyze the mechanism of AZ differentiation controlled by AP2 transcription factor. From the results of all these experiments, we want to interpret the effection of AZ differentiation, ethylene and ROS content in AZ, down stream genes of AP2, and the metabolites changes by the expression changes of AP2 transcription factor. We try to interpret the AZ differentiation mechanism controlled by AP2 gene from the aspects of cell biology, physiology and biochemistry, molecular biology, gene regulation, metabolomics. This project will provide the proof of utilization the Cassava AZ-related genes.

木薯具有优良抗旱特性的重要原因之一是干旱能诱导木薯离区分化形成而脱落一部分叶片以适应新的干旱环境。乙烯信号是调节离区分化的重要途径。前期木薯离区芯片杂交克隆到一个新AP2转录因子，GO功能及代谢途径分析、启动子元件分析、qPCR和体外互作表明该基因参与乙烯与活性氧（ROS）信号途径及调节木薯叶柄离区脱落相关基因。AP2类转录因子被证明参与种子脱落、抗病、抗逆、激素响应(乙烯)、衰老等多种信号途径。本项目拟利用木薯转基因技术获得过量表达和沉默下调的AP2转基因植株，通过对转基因植株的离区进行染色、石蜡切片，气相色谱，ROS荧光探针，染色质免疫共沉淀测序和气-质联用分析，从细胞、生理生化、基因调控和代谢组方面多角度比较分析AP2基因表达变化对离区分化，乙烯和ROS途径，AP2下游基因及其代谢产物的影响，以阐明AP2调控离区分化影响叶片脱落的分子机制。为利用木薯离区基因进行抗旱分子育种提供依据。

本项目在前期研究的基础上，从细胞、生理生化、基因调控和代谢方面多角度比较分析AP2基因表达变化对离区分化，乙烯和ROS途径，AP2下游基因及其代谢产物的影响，初步阐明了AP2调控离区分化影响叶片脱落的分子机制。主要结果如下：. 本项目首先利用了组学分析，筛选了干旱与乙烯处理木薯离区提前脱落中196个AP2基因表达情况。99个AP2/ERF基因既在干旱也在乙烯处理诱导的离区脱落过程中表达。并且，进一步研究表明，20个ERF亚家族基因在两种处理中具有类似的表达模式。我们对两种处理的离区中ACC氧化酶及其乙烯含量进行了分析，表明在两种处理下ACC氧化酶及其乙烯含量都有增加，并且，大多数的AP2/ERF基因在提早脱落的KU50种质比在延迟脱落的SC5种质表达量高。 . 在此基础上，我们选取了AP2进行深入研究，获得了AP2基因的转基因株系，并对该基因的12个阳性转化株系进行PCR，Southern杂交鉴定。.利用石蜡切片对AP2转基因株系离区分化进行了研究，通过对转基因与非转基因的离区取样并进行电子显微镜观察。结果表明，在转基因株系中，木薯叶枕离区细胞开始变小，变密并且严重变形。 . 利用液-质联用等技术对AP2转基因株系离区活性氧与抗氧化剂水平进行了研究，结果如下，在干旱的早期，无论是过氧化氢还是抗氧化剂APX都在转基因植株中下降的趋势，但在干旱的后期，过氧化氢和抗氧化剂的水平存在明显上升的趋势，说明随着干旱的进行，体内的ROS水平越来越多，以致于过表达AP2基因也不能完全清除。.利用液-质联用、气相色谱等技术对AP2转基因株系离区激素水平进行了分析研究，具体分析了生长素、ABA、乙烯合成前体等水平，发现这些激素水平在干旱早期与后期在转基因植株中存在着差异。. 利用RNA原位杂交对AP2在离区中的表达进行了原位分析，发现AP2在已分离的离区中有表达，说明AP2确实参与了木薯离区的调节，在此基础上，我们对AP2的互作基因进行了研究，利用BiFC,蛋白互作等方法验证了AP2能与脱落基因IDA相互作用，这可能是AP2调节脱落发生直接原因。

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